Ciecz c)	Średni czas narastania ciśnienia dla cieczy badanej zmieszanej w stosunku 1:1 (masowo) z celulozą (ms)
Dichromian amonu, nasycony roztwór wodny	20.800
Azotan wapnia, nasycony roztwór wodny	6.700
Azotan żelazowy, nasycony roztwór wodny	4.133
Nadchloran litu, nasycony roztwór wodny	1.686
Nadchloran magnezu, nasycony roztwór wodny	777
Azotan niklawy, nasycony roztwór wodny	6.250
Kwas azotowy, 65 %	4.767a)
Kwas nadchlorowy, 50 %	121a)
Kwas nadchlorowy, 55 %	59
Azotan potasu, 30 % roztwór wodny	26.690
Azotan srebra, nasycony roztwór wodny	-b)
Chloran sodu, 40 % roztwór wodny	a)
Azotan sodu, 45 % roztwór wodny	4.133
Substancja obojętna Woda: celuloza	-b)

Brak owrzodzenia i zmętnienia	0
Rozproszone lub rozsiane pola zmętnienia (inne niż nieznaczne zmatowienie normalnego blasku), szczegóły tęczówki wyraźnie widoczne	1
Łatwo dostrzegalne, przeświecające pola zmętnienia, szczegóły tęczówki nieznacznie zaciemnione	2
Zmętnione pola, szczegóły tęczówki niewidoczne, zarysy źrenicy ledwo dostrzegalne	3
Mętna rogówka, tęczówka niedostrzegalna przez zmętnienie	4

Maksymalna możliwa liczba punktów: 4
* Należy zapisać wielkość pola zmętnienia rogówki.
Tęczówka

Normalna	0
Wyraźnie pogłębione fałdy, przekrwienie, obrzęk, umiarkowane przekrwienie okołorogówkowe lub nastrzyknięcia, tęczówka reaguje na światło (powolną reakcję należy uznać jako skutek działania)	1
Wylewy krwawe, silna destrukcja lub brak reakcji na światło	2

Maksymalna możliwa liczba punktów: 2
Spojówka

Zaczerwienienie (odnosi się do spojówki gałki ocznej i powiekowej, wyłączając rogówkę i tęczówkę) normalne	0
Część naczyń krwionośnych przekrwiona (nastrzyknięta)	1
Rozlane zaczerwienienie o barwie purpurowej, pojedyncze naczynia trudno dostrzegalne	2
Rozlane zaczerwienienie o barwie silnie czerwonej	3

Maksymalna możliwa liczba punktów: 3
Obrzęk spojówki
Obrzęk (odnosi się do powieki i/lub błon mrużnych)

Normalna	0
Jakikolwiek obrzęk powyżej normalnego	1
Wyraźny obrzęk z częściowym wywinięciem powiek	2
Obrzęk z połowiczym przymknięciem powiek	3
Obrzęk z powiekami przymkniętymi ponad połowę	4

ZAŁĄCZNIK Nr 9

B.42. UCZULANIE SKÓRY: PRÓBA NA MIEJSCOWYM WĘŹLE CHŁONNYM

1. METODA

Niniejsza metoda jest równoważna metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 429 (2002).

1.1. Wstęp

Próba na Miejscowym Węźle Chłonnym (PMWCh) została wystarczająco uwierzytelniona i zaakceptowana, tak aby przyjąć ją jako nową metodę badawczą (zobacz pozycje 1, 2 i 3 piśmiennictwa). Jest to druga metoda służąca ocenie potencjału działania uczulającego substancji chemicznych na skórę zwierząt. Inna metoda opiera się na badaniu na świnkach morskich, a dokładniej jest to test maksymalizacji (B.6) i test Buehlera (zobacz pozycja 4 piśmiennictwa).
PMWCh jest metodą alternatywną dla wykrywania substancji chemicznych działających uczulająco na skórę lub dla potwierdzenia, że substancje chemiczne nie posiadają znaczącego potencjału wywołującego uczulanie skóry. Nie oznacza to, że w każdym przypadku można stosować PMWCh zamiast badań przeprowadzanych na świnkach morskich, ale raczej, że próba ta ma równą wartość i może być stosowana jako alternatywna, gdy wyniki pozytywne i negatywne nie wymagają z reguły dalszego potwierdzenia.
PMWCh ma pewne zalety zarówno z punktu widzenia postępu naukowego, jak i dobrostanu zwierząt. W metodzie tej bada się fazę indukcji uczulania skóry i uzyskuje ilościowe dane przydatne w szacowaniu zależności dawka-odpowiedź. Szczegóły walidacji PMWCh i przegląd towarzyszących prac opublikowano w piśmiennictwie (zobacz pozycje 5, 6, 7 i 8 piśmiennictwa). Ponadto należy odnotować, że substancje działające łagodnie/umiarkowanie uczulająco, które są zalecane jako odpowiednie do kontroli pozytywnej w metodach badań na świnkach morskich, również są odpowiednie w PMWCh (zobacz pozycje 6, 8 i 9 piśmiennictwa).
PMWCh jest metodą in vivo i w konsekwencji nie eliminuje stosowania zwierząt w ocenie kontaktowej aktywności uczulającej. Potencjalnie może jednak zmniejszyć liczbę zwierząt potrzebnych do osiągnięcia tego celu. Ponadto PMWCh stwarza znacznie łagodniejsze warunki, w jakich zwierzęta są stosowane w kontaktowym badaniu uczulenia. PMWCh opiera się na immunologicznych zjawiskach stymulowanych przez substancje chemiczne w fazie indukcyjnej uczulania. W przeciwieństwie do badań na świnkach morskich PMWCh nie wymaga wywoływania reakcji nadwrażliwości skórnej. Ponadto PMWCh nie wymaga stosowania adjuwanta, tak jak w metodzie maksymalizacji na świnkach morskich. Dlatego PMWCh zmniejsza obciążenie zwierząt. Pomimo zalet PMWCh w porównaniu do tradycyjnej metody na świnkach morskich, istnieją jednak pewne ograniczenia zmuszające do zastosowania tradycyjnej metody z świnkami morskimi (np. fałszywie negatywne wyniki dla niektórych metali w PMWCh, fałszywie pozytywne wyniki z niektórymi substancjami drażniącymi skórę) (zobacz pozycja 10 piśmiennictwa).
Zobacz także Wprowadzenie część B.

1.2. Zasada metody badawczej

Zasadą leżącą u podstaw PMWCh jest to, że substancje uczulające pobudzają pierwotne namnażanie się limfocytów w węźle chłonnym poddanemu miejscowemu działaniu substancji chemicznej. Namnażanie to jest proporcjonalne do podanej dawki (i do potencjału alergenu) i daje prosty sposób otrzymania obiektywnego, ilościowego pomiaru uczulenia. W PMWCh namnażanie to wycenia się jako zależność dawka-odpowiedź, a namnażanie w grupach narażanych porównuje się z namnażaniem w grupie kontrolnej z nośnikiem. Oznaczany jest stosunek namnażania w grupach narażanych i grupie kontrolnej, który nazywany jest Wskaźnikiem Stymulacji (WS). Aby badana substancja mogła być oceniona jako potencjalnie uczulająca skórę, musi on wynosić przynajmniej trzy. W opisanej metodzie do pomiarów namnażania się komórek stosuje się substancje znaczone radioaktywnie. Można jednak stosować inne sposoby do szacowania namnażania się komórek, pod warunkiem że jest to umotywowane i znajduje odpowiednie poparcie naukowe, zawierające pełne cytowania i opis metodologii.

1.3. Opis metody badawczej

1.3.1.  Przygotowania

1.3.1.1.   Warunki przetrzymywania i karmienia zwierząt

Temperatura w pomieszczeniach doświadczalnych powinna wynosić 22±3 °C. Wilgotność względna powinna wynosić 50-60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach między 30 % a 70 % (wyższa wartość jedynie podczas czyszczenia pomieszczeń). Należy stosować sztuczne oświetlenie: 12 godzin światła i 12 godzin ciemności. Do karmienia zwierząt powinna być stosowana typowa pasza laboratoryjna, należy zapewnić nieograniczony dostęp do wody.

1.3.1.2.   Przygotowanie zwierząt

Zwierzęta należy dobierać losowo, znakować dla umożliwienia indywidualnej identyfikacji (lecz nie za pomocą jakiegokolwiek znakowania uszu), przetrzymywać w klatkach przynajmniej 5 dni przed rozpoczęciem podawania substancji w celu aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych. Przed rozpoczęciem doświadczenia należy sprawdzić wszystkie zwierzęta, dla upewnienia się, czy nie posiadają widocznych uszkodzeń skóry.

1.3.2.  Warunki badania

1.3.2.1.   Zwierzęta doświadczalne

W tym badaniu gatunkiem z wyboru jest mysz. Należy użyć do badań samice myszy szczepu CBA/Ca lub CBA/J, które są dziewicze i nieciężarne. Przy rozpoczęciu badania zwierzęta powinny być w wieku 8-12 tygodni, a różnica w masie ciała zwierząt powinna być jak najmniejsza i nie przekraczać 20 % średniej masy. Można używać innych szczepów i samców, gdy są wystarczające dane dla wykazania, że nie istnieją istotne specyficzne różnice w odpowiedzi w PMWCh zależne od szczepu i/lub płci.

1.3.2.2.   Sprawdzenie wiarygodności

Do wykazania właściwego przeprowadzenia próby i kompetencji laboratorium do prawidłowego wykonania doświadczenia stosuje się kontrolę pozytywną. Kontrola pozytywna powinna dać w PMWCh pozytywną odpowiedź na poziomie narażenia, dla którego przewiduje się wzrost wskaźnika stymulacji (WS) <3 w stosunku do kontroli negatywnej. Dawkę w kontroli pozytywnej należy dobrać tak, by indukcja była wyraźna, lecz nie nadmierna. Zalecanymi substancjami są aldehyd heksylocynamonowy (No CAS 101-86-1, No EINECS 202-983-3) i merkaptobenzotiazol (No CAS 149-30-4, No EINECS 205-736-8). W określonych warunkach, po odpowiednim uzasadnieniu, można użyć innych substancji kontrolnych spełniających powyższe kryteria. Kontrola pozytywna wymagana jest zazwyczaj w każdym doświadczeniu, lecz mogą być sytuacje, gdy laboratoria badawcze posiadają dane archiwalne dotyczące kontroli pozytywnej, wskazujące na stałość zadowalających reakcji przez okres sześciu miesięcy lub dłuższy. W takich sytuacjach rzadsze sprawdzanie za pomocą kontroli pozytywnej jest właściwe, lecz w odstępach nie dłuższych niż 6 miesięcy. Chociaż pozytywną kontrolę substancji należy sprawdzać w nośniku, o którym wiadomo, że wywołuje stałą odpowiedź (np. aceton: oliwa z oliwek), to mogą wystąpić szczególne okoliczności określone w odrębnych przepisach, w których będzie również konieczne przebadanie w niestandardowym nośniku (odpowiednia formulacja o znaczeniu klinicznym/chemicznym). W takich sytuacjach należy przebadać możliwą interakcję pozytywnej kontroli z niekonwencjonalnym nośnikiem.

1.3.2.3    Liczba zwierząt, poziom dawkowania i wybór nośnika

Należy stosować minimum po cztery zwierzęta w grupach narażanych i co najmniej trzy stężenia badanej substancji, grupę kontroli negatywnej otrzymującej jedynie nośnik badanej substancji i grupę kontroli pozytywnej, o ile stosowne. W przypadkach, w których wycenia się dane indywidualnych zwierząt, należy stosować minimum pięć zwierząt w grupie. Zwierzęta z grup kontrolnych należy traktować w ten sam sposób jak z grup narażonych, z wyjątkiem podawania badanej substancji.
Dobór dawek i nośnika należy opierać o zalecenia z publikacji (zobacz pozycja 1 piśmiennictwa). Dawki należy dobrać z serii stężeń 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Gdy są dostępne wyniki ostrej toksyczności skórnej i drażnienia skóry, należy je brać pod uwagę przy doborze tych trzech kolejnych stężeń tak, by przy narażeniu na najwyższe stężenie uniknąć toksyczności ogólnoustrojowej i nadmiernego miejscowego podrażnienia skóry (zobacz pozycje 2 i 11 piśmiennictwa).
Nośnik należy dobierać, uwzględniając maksymalne stężenia substancji stosowanej w badaniu i maksymalną rozpuszczalność, by można uzyskać roztwory/zawiesiny odpowiednie dla podawania badanej substancji. Zaleca się nośniki w następującej kolejności: aceton/oliwa z oliwek (4:1 v/v), dimetyloformamid, keton metyloetylowy, propylenoglikol i dimetylosulfotlenek (zobacz pozycje 2 i 10 piśmiennictwa), ale mogą być również stosowane inne nośniki, o ile dysponuje się o nich odpowiednią wiedzą naukową. W niektórych przypadkach konieczne może być używanie, jako dodatkowej kontroli, rozpuszczalnika stosowanego jako materiał do formulacji handlowej badanej substancji lub rozpuszczalnika ważnego z klinicznego punktu widzenia. W szczególności należy zapewnić, aby materiały hydrofilne były podawane z zastosowaniem nośnika, który zwilża skórę i nie spływa natychmiast. Dlatego należy unikać stosowania jedynie wodnych nośników.

1.3.3.  Sposób postępowania

1.3.3.1.   Plan doświadczenia

Plan doświadczenia jest następujący:
-    Dzień 1:
Ustalanie i zapisywanie indywidualnej masy ciała dla każdego zwierzęcia. Nanoszenie 25 µl odpowiedniego roztworu badanej substancji, samego nośnika lub kontroli pozytywnej (jeżeli są stosowane) na grzbietową stronę każdego ucha zwierzęcia.
-    Dzień 2 i 3:
Powtórzyć procedurę nanoszenia jak w dniu 1.
-    Dzień 4 i 5:
Brak narażenia.
-    Dzień 6:
Zapisać masę ciała każdego zwierzęcia. Każdej myszy, której podawano substancję, i myszy z grupy kontrolnej wstrzyknąć do żyły ogonowej po 250 µl roztworu buforu fosforanowego (PBS) zawierającego 20 µCi (7,4e+8 Bq) 3H-metylotymidyny. Alternatywnie wstrzyknąć 250 (l roztworu PBS zawierającego 2 µCi (7,4e+7 Bq) 125l-jododeoksyurydyny i 10-5 M fluorodeoksyurydyny wszystkim myszom do żyły ogonowej.
Po pięciu godzinach zwierzęta należy uśmiercić. Zwierzętom narażonym na substancję należy z każdego ucha wyciąć przyuszne węzły chłonne i zanurzyć w PBS. Z każdej badanej grupy (badanie w sposób grupowy) alternatywnie należy wyciąć pary węzłów chłonnych od każdego zwierzęcia i zanurzyć w PBS osobno dla każdego zwierzęcia (sposób indywidualny). Szczegóły i wykresy identyfikacji węzłów i analizy można znaleźć w załączniku I do pozycji piśmiennictwa (zobacz pozycja 10 piśmiennictwa).

1.3.3.2.   Przygotowanie zawiesiny komórek

Zawiesiny komórek węzła chłonnego otrzymane ze zwierząt, badanych zarówno grupowo lub jak i od pojedynczych zwierząt, przygotowuje się poprzez łagodne mechaniczne rozdrobnienie na nierdzewnej siatce stalowej o oczkach 200 µm. Komórki węzła chłonnego przemywa się dwukrotnie PBS dodanym w nadmiarze i wytrąca 5 % kwasem trichlorooctowym (TCA) w temp. 4 °C przez 18 godzin (zobacz pozycja 2 piśmiennictwa). Granulki należy ponownie zawiesić w 1 ml kwasu trichlorooctowego i przenieść do fiolki scyntylacyjnej zawierającej 10 ml płynu scyntylacyjnego dla zliczenia 3H, lub przenieść bezpośrednio do probówki pomiarów gamma dla zliczenia 125l.

1.3.3.3.   Oznaczanie namnażania się komórek (radioaktywność związana)

Związanie 3H-metylotymidyny mierzy się za pomocą licznika b-scyntylacyjnego jako liczbę rozpadów na minutę. Związanie 125 l-jododeoksyurydyny mierzy się za pomocą licznika 125l scyntylacyjnego i wyraża się również w postaci liczby rozpadów na minutę. W zależności od stosowanego sposobu badania wiązania wyraża się w postaci liczby rozpadów na minutę/narażana grupa (sposób grupowy) lub rozpad na minutę/zwierzę (sposób indywidualny).

1.3.3.4.   Obserwacje

1.3.3.4.1.   Obserwacje kliniczne

Zwierzęta należy obserwować starannie raz w ciągu dnia pod kątem objawów klinicznych albo miejscowego drażnienia w miejscach podania lub toksyczności ogólnoustrojowej. Wszystkie obserwacje łącznie z zapisami dla pojedynczych zwierząt należy systematycznie zapisywać.

1.3.3.4.2.   Masa ciała

Jak podano w pkt 1.3.3.1, masy ciała pojedynczych zwierząt należy ustalać na początku doświadczenia i przed planowym uśmierceniem zwierząt.

1.3.4.  Obliczanie wyników

Wyniki należy wyrazić w formie Wskaźnika Stymulacji (WS). Gdy stosuje się sposób grupowy, WS otrzymuje się dzieląc, związaną radioaktywność dla każdej narażanej grupy przez przyłączoną radioaktywność grupy kontrolnej z nośnikiem; to daje średni WS. Gdy stosuje się sposób indywidualny, WS oblicza się, dzieląc średni rozpad na minutę/mysz w ramach każdej narażanej grupy i grupę pozytywnej kontroli przez średni rozpad na minutę/mysz dla grupy kontrolnej rozpuszczalnik/nośnik. Średni WS dla grup kontrolnych z nośnikiem wynosi wtedy 1.
Zastosowanie sposobu indywidualnego do wyliczenia WS umożliwia przeprowadzenie statystycznej analizy wyników. Przy wyborze odpowiedniej metody analizy statystycznej badacz musi być świadomy możliwych nierówności wariancji i innych związanych z tym problemów, co może wymagać przetworzenia danych lub zastosowania nieparametrycznej analizy statystycznej. Za pomocą odpowiedniego sposobu interpretacji należy ocenić wszystkie indywidualne dane narażanych i kontrolnych zwierząt i dopasować na tej podstawie stosowną krzywą zależności dawka-odpowiedź, biorąc pod uwagę przedziały ufności (zobacz pozycje 8, 12 i 13 piśmiennictwa). Jednak badacz musi uważać na możliwe skrajne reakcje indywidualnych zwierząt wewnątrz grup, co może wymagać stosowania alternatywnych miar reakcji (np. raczej mediany, a nie średniej) lub eliminowania skrajnych danych.
Proces podejmowania decyzji odnośnie pozytywnej reakcji obejmuje WS ł3, łącznie z rozważeniem reakcji dawka-odpowiedź, i, o ile stosowne, istotności statystycznej (zobacz pozycje 3, 6, 8, 12 i 14 piśmiennictwa).
Jeżeli zachodzi potrzeba objaśnienia otrzymanych wyników, należy zwrócić uwagę na różne właściwości badanej substancji, w tym strukturalne podobieństwo do znanych substancji uczulających skórę, czy zdolność powodowania silnego drażnienia skóry i rodzaj reakcji dawka-odpowiedź. Te i inne okoliczności dyskutowane są szczegółowo w innym miejscu (zobacz pozycja 7 piśmiennictwa).

2. WYNIKI

Wyniki należy zestawić w formie tabel, wykazując średnie i pojedyncze wartości rozpadu na minutę i wskaźniki stymulacji dla każdej badanej grupy (w tym grupa kontrolna z nośnikiem).

3. SPRAWOZDANIE

Sprawozdanie powinno zawierać następujące informacje:
Badana substancja:
-    dane identyfikacyjne (np. numer CAS (jeżeli jest dostępny); źródło pochodzenia; stopień czystości; znane zanieczyszczenia; numer serii),
-    stan skupienia i właściwości fizykochemiczne (np. lotność, trwałość, rozpuszczalność),
-    w przypadku mieszanin skład i zawartość składników.
Nośnik:
-    dane identyfikacyjne (stopień czystości; stężenie, o ile dotyczy; stosowana objętość),
-    uzasadnienie wyboru nośnika.
Zwierzęta doświadczalne:
-    szczep stosowanych myszy,
-    stan mikrobiologiczny zwierząt, jeżeli jest znany,
-    liczba, wiek i płeć zwierząt,
-    źródło pochodzenia, warunki przetrzymywania, pasze itd.
Warunki przeprowadzania badania:
-    szczegóły przygotowania badanej substancji i jej podawanie,
-    uzasadnienie wyboru dawek (łącznie z wynikami testu poszukiwania zakresu dawek, jeżeli prowadzono); stosowane stężenia badanej substancji i nośnika i ogólna ilość podawanej substancji,
-    szczegóły jakości paszy i wody (łącznie z typem paszy i źródłem dostawy, źródło wody).
Sprawdzenie wiarygodności:
-    podsumowanie wyników ostatniego sprawdzenia wiarygodności, łącznie z informacjami o substancji, stężeniu i stosowanym nośniku,
-    równolegle uzyskane i/lub archiwalne pozytywne i negatywne dane kontrolne dla badającego laboratorium.
Wyniki:
-    indywidualne masy ciała zwierząt na początku narażenia i przy planowanym ich uśmiercaniu;
-    tabela z podaniem wartości średniej/mediany (sposób grupowy) lub indywidualnych (sposób indywidualny) rozpadu na minutę, jak również zakres wartości dla obu sposobów i wskaźników stymulacji dla każdej badanej grupy (łącznie z kontrolą nośnika),
-    analiza statystyczna, gdy była stosowana,
-    czas wystąpienia i objawy toksyczne, włącznie z podrażnieniem skóry w miejscu nałożenia, gdy wystąpiło, dla każdego zwierzęcia.
Dyskusja wyników:
-    krótki komentarz do wyników, do analizy zależności dawka-odpowiedź i analizy statystycznej, gdy były stosowane, z wnioskiem czy badana substancja może być uznana za uczulającą skórę.

4. PIŚMIENNICTWO

 1)   Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992). The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food and Chemical Toxicology, 30, 165-169.
 2)   Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicology, 93, 13-31.
 3)   Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A. Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E., Hastings, K.L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. Journal of Toxicology and Environmental Health, 53, 563-79 (1998).
 4)   OECD (1992). Guideline 406 Skin Sensitisation.
 5)   Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food and Chemical Toxicology, 34, 999-1002.
 6)   Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996) The local lymph node assay Aviable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, 985-997.
 7)   Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology. (in press) 36, 327-33.
 8)   Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J., Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assaay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, 49-59.
 9)   Dearman, R.J., Hilton, J, Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998). Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18, 281-4.
 10)  National Institute of Environmental Health Sciences (1999). The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494, Research Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov.).
 11)  OECD (2002). Guideline 404 Acute Dermal Irritation/Corrosion.
 12)  Basketter, D.A., Selbie, E., Scholes, E.W., Lees, D., Kimber, I. and Botham, P.A. (1993). Results with OECD recommended positive control sensitisers in the maximisation. Buehler and local lymph node assays. Food and Chemical Toxicology, 31, 63-67.
 13)  Basketter, D.A., Lea, L.J., Dickens, A., Briggs, D., Pate, I., Dearman, R.J., Kimber, I. (1999). A comparison of statistical approaches to the derivation of EC3 values from local lymph node assay dose responses. J. Appl. Toxicology, 19, 261-266.
 14)  Basketter, D.A., Blaikie, L., Dearman, R.J., Kimber, I., Ryan, C.A., Gerberick, G.F., Harvey, P., Evans, P., White, I.R. and Rycroft, R.T.G. (2000). Use of local lymph node assay for the estimation of relative contact allergenic potency. Contact Dermatitis, 42, 344-48.

ZAŁĄCZNIK Nr 10

B.43. BADANIE NEUROTOKSYCZNOŚCI NA GRYZONIACH

1. METODA

Niniejsza metoda jest równoważna metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 424 (1997).
Badanie przeprowadzone zgodnie z niniejszą metodą badawczą ma na celu dostarczenie informacji koniecznych dla potwierdzenia lub dalszego scharakteryzowania potencjalnej neurotoksyczności substancji chemicznych u dorosłych zwierząt. Może ona być łączona z innymi metodami badawczymi przy powtarzanym podawaniu dawki bądź też może być wykonywana jako oddzielne badanie. W projektowaniu badań opartych o niniejszą metodę badawczą zaleca się korzystanie z Dokumentu Przewodniego OECD dotyczącego strategii i metod badawczych neurotoksyczności (zobacz pozycja 1 piśmiennictwa). Jest to szczególnie ważne, gdy dokonuje się modyfikacji obserwacji i procedur badawczych zalecanych przy rutynowym stosowaniu niniejszej metody. Dokument Przewodni został przygotowany dla ułatwienia wyboru innych procedur badawczych stosowanych w szczególnych okolicznościach.
Oszacowanie neurotoksyczności rozwojowej nie jest przedmiotem niniejszej metody.

1.1. Wstęp

W szacowaniu i ocenie toksycznego charakteru substancji chemicznych ważne jest, aby wziąć pod uwagę potencjalne wystąpienie skutków neurotoksycznych. Już metoda badawcza przy powtarzanym podawaniu dawki uwzględnia obserwacje pod kątem potencjalnej neurotoksyczności. Niniejsza metoda badawcza może być stosowana w planowaniu badania mającego na celu uzyskanie dalszych informacji, bądź ich potwierdzeniu, co do skutków neurotoksycznych obserwowanych w badaniach toksyczności przy powtarzanym narażeniu. Uwzględnienie jednak możliwej neurotoksyczności pewnych klas substancji chemicznych może sugerować, że jest ona bardziej właściwie oszacowana przez niniejszą metodę bez wcześniejszych ustaleń możliwej neurotoksyczności w badaniach przy powtarzanym dawkowaniu. Takie rozważania zawierają na przykład:
-   obserwacje objawów neurologicznych lub zmian neuropatologicznych w badaniach toksyczności innych niż te z powtarzanym dawkowaniem lub
-   strukturalne pokrewieństwo lub inne informacje łączące je ze znanymi substancjami o działaniu neurotoksycznym.
Ponadto mogą wystąpić inne przypadki, gdy zastosowanie niniejszej metody badawczej jest właściwe; dalsze szczegóły można znaleźć w piśmiennictwie (zobacz pozycja 1 piśmiennictwa).
Niniejszą metodę opracowano w taki sposób, aby mogła być przystosowana do spełnienia szczególnych potrzeb, potwierdzić specyficzną neurotoksyczność histopatologiczną lub behawioralną substancji chemicznej, a także dostarczyć charakterystykę i ocenę ilościową reakcji neurotoksycznych.
W przeszłości neurotoksyczność przyrównywano do neuropatii obejmującej zmiany neuropatologiczne lub zaburzenia neurologiczne, takie jak napad padaczkowy, paraliż lub drżenie. Chociaż neuropatia jest ważnym objawem neurotoksyczności to obecnie oczywistym jest, że istnieje wiele innych objawów toksyczności w układzie nerwowym (np.: utrata koordynacji motorycznej, osłabienie czucia, zaburzenia w uczeniu i zapamiętywaniu), które nie mają odbicia w neuropatii lub innych rodzajach badań.
Niniejsza metoda badawcza dotycząca neurotoksyczności przeznaczona jest do wykrywania głównych skutków neurobehawioralnych i neuropatologicznych u dorosłych gryzoni. Podczas gdy skutki behawioralne, nawet pod nieobecność zmian morfologicznych, mogą odzwierciedlać szkodliwy wpływ na organizm, to nie wszystkie zmiany behawioralne są specyficzne dla układu nerwowego. Dlatego każda obserwowana zmiana powinna być oszacowana w połączeniu z danymi histopatologicznymi, hematologicznymi lub biochemicznymi, jak również wynikami innego rodzaju badań toksyczności układowej. Do badań ujętych w niniejszej metodzie mających na celu dostarczenie charakterystyki i oceny ilościowej reakcji neurotoksycznych zalicza się procedury histopatologiczne i behawioralne, które mogą być dalej uzupełnione przez badania elektrofizjologiczne i/lub biochemiczne (zobacz pozycje 1, 2, 3 i 4 piśmiennictwa).
Substancje neurotoksyczne mogą działać na wiele miejsc w obrębie układu nerwowego za pomocą wielu mechanizmów. Żaden pojedynczy zestaw testów nie jest w stanie w pełni oszacować potencjału neurotoksycznego wszystkich substancji chemicznych, dlatego konieczne może być zastosowanie innych badań in vivo lub in vitro specyficznych dla rodzaju obserwowanej lub przewidywanej neurotoksyczności.
Niniejsza metoda badawcza może być także stosowana w połączeniu z wytycznymi zawartymi w Dokumencie Przewodnim OECD na temat strategii i metod badawczych neurotoksyczności (zobacz pozycja 1 piśmiennictwa), do planowania badań zamierzających dalej charakteryzować lub zwiększać czułość oceny ilościowej typu dawka-odpowiedź lub lepiej oszacować poziom bez obserwowanego szkodliwego działania lub uzasadnić znane lub spodziewane zagrożenia powodowane przez substancję. Na przykład można zaplanować badanie mające na celu identyfikację i oszacowanie mechanizmów neurotoksycznych lub uzupełnić dane już istniejące z podstawowych obserwacji neurobehawioralnych i neuropatologicznych. Takie badania nie muszą powtarzać danych, które byłyby wygenerowane z zastosowania standardowych procedur niniejszej metody, jeżeli takie dane już istnieją i nie są uważane za niezbędne do interpretacji wyników badania.
Badanie neurotoksyczności, wykonywane osobno lub w połączeniu, dostarcza informacji, które mogą:
-   stwierdzać, czy badana substancja działa na układ nerwowy w sposób odwracalny lub nieodwracalny,
-   przyczynić się do charakterystyki zmian w układzie nerwowym towarzyszącym narażeniu na badaną substancję i do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw tych zmian,
-   określić zależności między wielkością dawki a czasem wystąpienia odpowiedzi (reakcji) celem oszacowania poziomu bez obserwowanego działania szkodliwego (stosowanego do określenia kryteriów bezpieczeństwa substancji chemicznej).
Niniejsza metoda badawcza opiera się na podawaniu badanej substancji drogą pokarmową. Inne drogi podawania (np.: przez skórę lub drogą inhalacyjną) mogą być bardziej właściwe, ale mogą wtedy wymagać modyfikacji zalecanych procedur. Wybór drogi podawania zależy od sposobu narażenia człowieka i dostępnych informacji toksykologicznych lub kinetycznych.

1.2. Definicje

Szkodliwy skutek: jest każdą zmianą w stosunku do wyjściowej zależną od narażenia, która zmniejsza zdolność organizmu do przeżycia, rozmnażania się lub przystosowania do środowiska.
Dawka: jest ilością podanej substancji. Dawkę wyraża się jako masę (np. mg) lub jako masę badanej substancji na jednostkę masy zwierzęcia doświadczalnego (np. mg/kg), lub jako stałe stężenie w paszy.
Dawkowanie: jest pojęciem ogólnym obejmującym dawkę, jej częstotliwość i czas trwania jej podawania.
Neurotoksyczność: jest szkodliwą zmianą w strukturze lub funkcjonowaniu układu nerwowego, która wynika z narażenia na czynnik biologiczny, chemiczny lub fizyczny.
Czynnik neurotoksyczny: to każdy czynnik biologiczny, chemiczny lub fizyczny posiadający możliwość spowodowania neurotoksyczności.
NOAEL: skrót dla poziomu dawkowania bez obserwowanego szkodliwego skutku, jest to najwyższy poziom dawki, przy którym nie obserwuje się szkodliwych skutków związanych z narażeniem.

1.3. Zasada metody badawczej

Badana substancja podawana jest drogą pokarmową w szeregu dawek kilku grupom gryzoni laboratoryjnych. Wymagane jest powtarzane podawanie dawek, a czas dawkowania powinien być 28-dniowy, podprzewlekły (90 dni) lub przewlekły (1 rok lub dłużej). Procedury przedstawione w niniejszej metodzie badawczej mogą być także wykorzystane do badania ostrej neurotoksyczności. Zwierzęta są badane celem wykrycia lub scharakteryzowania nieprawidłowości behawioralnych i/lub neurologicznych. Rozpiętość zmian behawioralnych, które mogą być spowodowane przez substancję neurotoksyczną, jest określana w każdym okresie obserwacji. Pod koniec badania część zwierząt każdej płci z każdej grupy poddaje się perfuzji in situ i wykonuje sekcję mózgu, rdzenia kręgowego i nerwów obwodowych.
Gdy doświadczenie jest prowadzone jako samodzielne badanie służące stwierdzeniu neurotoksyczności lub charakterystyce skutków neurotoksycznych, to zwierzęta w każdej grupie nieużyte do perfuzji i badań histopatologicznych (zobacz tabela B.43.1) mogą być użyte do specyficznych badań neurobehawioralnych, neuropatologicznych, neurochemicznych lub elektrofizjologicznych, które uzupełnią dane otrzymane w standardowych badaniach wymaganych przez niniejszą metodę (zobacz pozycja 1 piśmiennictwa). Te dodatkowe procedury mogą być szczególnie użyteczne, gdy obserwacje empiryczne lub przewidywane skutki wskazują na specyficzny rodzaj lub cel neurotoksyczności substancji chemicznej. Pozostałe zwierzęta mogą być także stosowane alternatywnie do oszacowań, takich jak te podane w metodach badawczych przy powtarzanym dawkowaniu na gryzoniach.
Gdy postępowanie według niniejszej metody jest łączone z postępowaniem wymaganym przez te inne metody, to wtedy potrzebna jest wystarczająca liczba zwierząt, by zapewnić obserwacje w obydwu badaniach.

1.4. Opis metody badawczej

1.4.1.  Wybór gatunku zwierząt

Zalecanym gatunkiem gryzoni jest szczur, chociaż inne gatunki gryzoni również mogą być stosowane po odpowiednim uzasadnieniu. Stosować należy powszechnie używane szczepy laboratoryjne młodych, zdrowych zwierząt. Samice powinny być dziewicze i nieciężarne. Dawkowanie powinno rozpocząć się jak najszybciej po odstawieniu nie później niż w wieku 6 tygodni, a w żadnym przypadku w wieku ponad 9 tygodni. Jeżeli jednak niniejsze badanie jest łączone z innymi, to wymagania co do wieku zwierząt mogą ulec pewnym modyfikacjom. Na początku doświadczenia różnica masy ciała nie powinna przekraczać ±20 % średniej masy ciała każdej płci. Jeżeli doświadczenie krótkoterminowe z powtarzanym dawkowaniem prowadzone jest jako wstęp do badania długoterminowego, to w obydwu doświadczeniach należy stosować takie same szczepy zwierząt.

1.4.2.  Warunki przetrzymywania i karmienia zwierząt

Temperatura w pomieszczeniach doświadczalnych powinna wynosić 22±3 °C. Wilgotność względna powinna wynosić 50-60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach między 30 % a 70 % (wyższa wartość jedynie podczas czyszczenia pomieszczeń). Należy stosować sztuczne oświetlenie: 12 godzin światła i 12 godzin ciemności. Natężenie hałasu należy ograniczyć do minimum. Do karmienia zwierząt powinna być stosowana typowa pasza laboratoryjna, należy zapewnić nieograniczony dostęp do wody. Na wybór pokarmu może wpływać konieczność zapewnienia odpowiedniego zmieszania badanej substancji, gdy taki jest jej sposób podawania. Zwierzęta można przetrzymywać indywidualnie lub w małych grupach tej samej płci.

1.4.3.  Przygotowanie zwierząt

Zdrowe, młode zwierzęta są w sposób losowy przypisywane do grup narażanych i kontrolnej. Klatki powinny być umiejscowione w taki sposób, aby zminimalizować ewentualne skutki wynikające z ich usytuowania. Zwierzęta są jednoznacznie znakowane i trzymane w klatkach przez przynajmniej 5 dni przed rozpoczęciem badania celem aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych (zobacz pozycja 5 piśmiennictwa).

1.4.4.  Sposób podawania i przygotowanie dawek

Niniejsza metoda badawcza przeznaczona jest do podawania badanej substancji drogą pokarmową. Podawanie drogą pokarmową może być wykonywane za pomocą sondy, w paszy, wodzie pitnej lub kapsułkach. Inne sposoby podawania (np. przez skórę lub drogą inhalacyjną) mogą być stosowane, ale mogą wymagać modyfikacji stosowanych procedur. Wybór drogi narażania zależy od profilu narażenia ludzi i dostępnych informacji toksykologicznych i kinetycznych. Należy podać uzasadnienie wyboru drogi narażenia i wynikające stąd modyfikacje procedur metody badawczej.
Jeżeli to konieczne, to badana substancja może być rozpuszczona lub zawieszona w odpowiednim nośniku. W pierwszej kolejności zaleca się stosowanie roztworów/zawiesin wodnych, a w dalszej kolejności roztworów/zawiesin olejowych (np. w oleju kukurydzianym) i w końcu roztworów/zawiesiny w innych nośnikach. Charakterystyka toksykologiczna nośnika powinna być znana. Ponadto należy uwzględnić następujące właściwości nośnika: wpływy nośnika na absorpcję, rozmieszczenie, metabolizm i retencję badanej substancji, które mogą zmienić jej charakterystykę toksykologiczną, wpływy na konsumpcję paszy i spożycie wody lub stan odżywienia zwierząt.

1.5. Sposoby postępowania

1.5.1.  Liczba i płeć zwierząt

Jeżeli badanie wykonywane jest jako oddzielne, to wtedy należy stosować przynajmniej 20 zwierząt (10 samic i 10 samców) w każdej grupie narażanej i kontroli celem dokonania szczegółowych obserwacji klinicznych i czynnościowych. Przynajmniej pięć samic i pięć samców z tych dziesięciu samców i dziesięciu samic powinno być poddane perfuzji in situ i użytych do szczegółowych badań neurohistopatologicznych pod koniec doświadczenia. W przypadkach gdy tylko ograniczona liczba zwierząt w danej grupie dawkowej przejawia oznaki skutków neurotoksycznych, należy uwzględnić te zwierzęta wśród tych przeznaczonych do perfuzji. Jeżeli badanie jest wykonywane w połączeniu z innym przy powtarzanym dawkowaniu, to należy stosować odpowiednie liczby zwierząt tak, by spełnić wymagania obydwu metod. Minimalne liczby zwierząt na grupę w różnych kombinacjach badań podano w tabeli B.43.1. Jeżeli planuje się likwidację zwierząt w trakcie doświadczenia bądź też dodatkowe grupy celem obserwacji odwracalności, trwałości lub opóźnionego wystąpienia skutków toksycznych po narażeniu lub gdy planuje się dodatkowe obserwacje, to wtedy liczba zwierząt powinna być zwiększona tak, by zapewnić zwierzęta potrzebne do obserwacji i badań histopatologicznych.

1.5.2.  Grupy narażane i kontrolne

Ogólnie stosować należy przynajmniej trzy grupy narażane i grupę kontrolną, ale jeżeli na podstawie innych danych nie przewiduje się skutków przy powtarzanym dawkowaniu dawki 100 mg/kg masy ciała/dzień, to można wykonać badanie przy zastosowaniu dawki granicznej. Jeżeli brak jest wiarygodnych danych, to można przeprowadzić badanie wstępne celem ustalenia zakresu dawek w badaniu właściwym. Zwierzęta grupy kontrolnej powinny być traktowane tak samo pod każdym względem jak zwierzęta narażane, z wyjątkiem podawania badanej substancji. Jeżeli przy podawaniu badanej substancji stosuje się nośnik, to grupa kontrolna powinna otrzymywać nośnik w najwyższej zastosowanej objętości.

1.5.3.  Sprawdzenie wiarygodności

Laboratorium wykonujące badanie powinno przedstawić dane wykazujące jego zdolność do wykonania badania i czułość stosowanych sposobów postępowania. Takie dane powinny dostarczać dowodów na zdolność do wykrywania i ilościowej oceny, o ile dotyczy, zmian w różnych parametrach zalecanych do obserwacji, takich jak objawy autonomiczne, reakcje na bodźce, siła uchwytu i aktywność ruchowa. Informacje o substancjach, które powodują różne rodzaje reakcji neurotoksycznych i mogą być stosowane jako kontrola pozytywna, można znaleźć w pozycjach od 2 do 9 piśmiennictwa. Dane archiwalne mogą być stosowane, jeżeli podstawowe aspekty sposobów postępowania pozostają takie same. Zalecana jest okresowa aktualizacja danych archiwalnych. Nowe dane wykazujące ciągłą czułość sposobów postępowania powinny być wygenerowane, gdy jakieś podstawowe elementy badania lub sposobu postępowania zostały zmienione przez laboratorium wykonujące.

1.5.4.  Wybór dawek

Przy doborze poziomu dawek powinny być brane pod uwagę jakiekolwiek wcześniejsze obserwacje toksykologiczne i kinetyczne dostępne dla badanego związku lub materiałów podobnych. Najwyższy poziom dawkowania należy dobrać w taki sposób, by wywołać skutki neurotoksyczne lub wyraźne toksyczne skutki ogólnoustrojowe. W dalszej kolejności malejąca sekwencja dawek powinna być dobrana w taki sposób, by wykazać zależność typu dawka-odpowiedź i poziom bez obserwowanego działania szkodliwego (NOAEL) w najniższej dawce. W zasadzie poziomy dawkowania należy dobrać w taki sposób, by pierwotne działanie toksyczne na układ nerwowy można byłoby odróżnić od wpływów związanych z toksycznością ogólnoustrojową. Stosowanie dwóch do trzech przedziałów jest optymalne, a często dodatkowa czwarta grupa jest lepsza niż stosowanie bardzo dużych przedziałów (np. większych niż 10) pomiędzy dawkami. Tam gdzie istnieje wiarygodna ocena narażenia ludzi, to także ona powinna być brana pod uwagę.

1.5.5.  Badanie przy zastosowaniu dawki granicznej

Jeżeli badanie w jednej dawce na poziomie przynajmniej 1.000 mg/kg masy ciała/dzień, przy zastosowaniu procedury opisanej w niniejszej metodzie, nie daje rezultatu w postaci możliwych do zaobserwowania skutków neurotoksycznych i jeżeli nie należało się spodziewać skutków na podstawie istniejących danych co do strukturalnie podobnych związków, to wtedy pełne badanie z trzema poziomami dawek może być uważane za niepotrzebne. Spodziewane narażenie ludzi może wskazywać na potrzebę zastosowania wyższej dawki stosowanej doustnie w badaniu dawki granicznej. W przypadku innych sposobów podawania, takich jak inhalacyjne bądź skórne, własności fizykochemiczne badanej substancji, takie jak rozpuszczalność, często mogą wskazywać na maksymalny możliwy do uzyskania poziom narażenia. W badaniu ostrym doustnym dawka w badaniu dawki granicznej powinna wynosić przynajmniej 2.000 mg/kg.

1.5.6.  Podawanie dawek

Zwierzęta są narażane codziennie, siedem dni w tygodniu, przez przynajmniej 28 dni; zastosowanie 5-dniowego reżimu dawkowania lub krótszego czasu narażenia musi być uzasadnione. Gdy substancja podawana jest sondą, należy podawać pojedyncze dawki, stosując odpowiednią sondę żołądkową lub kaniulę intubacyjną. Maksymalna objętość cieczy, która może być podana jednorazowo, zależy od rozmiarów zwierzęcia. Objętość nie powinna przekraczać 1 ml/100 g masy ciała. Jednakże w przypadku roztworów wodnych można brać pod uwagę użycie 2 ml/100 g masy ciała. Należy zminimalizować zmiany objętości, dostosowując stężenia tak, by zapewnić stałą objętość na wszystkich poziomach dawek poza substancjami drażniącymi i żrącymi, które w wyższych stężeniach mogą zwiększyć skutki działania.
W przypadku substancji podawanych z paszą lub wodą pitną ważne jest, by zapewnić, że wprowadzenie odpowiedniej ilości badanej substancji nie zakłóci normalnego żywienia lub bilansu wodnego zwierzęcia. Gdy badana substancja podawana jest w paszy, należy stosować stałe stężenie w paszy (ppm) lub stałe dawki w stosunku do masy ciała; należy opisać stosowany sposób. Jeżeli substancja podawana jest sondą, to powinno to następować o mniej więcej stałych porach każdego dnia i być dostosowywane na stałym poziomie względem masy ciała. Gdy badanie przy powtarzanym podawaniu pokarmowym jest stosowane jako wstęp do badania długoterminowego, to w obydwu badaniach stosować należy taką samą paszę. W badaniach ostrych, jeżeli zastosowanie pojedynczej dawki jest niemożliwe, to należy podawać substancję w mniejszych częściach przez okres czasu nieprzekraczający 24 godzin.

1.6. Obserwacje

1.6.1.  Częstotliwość obserwacji i badań

W badaniach z powtarzanym dawkowaniem okres obserwacji powinien pokrywać okres dawkowania. W badaniach ostrych po narażeniu należy stosować 14-dniowy okres obserwacji. Dla zwierząt grup satelitarnych, które są przetrzymywane bez narażania przez ustalony czas po zakończeniu dawkowania, obserwacje powinny pokrywać się z tym czasem.
Obserwacje należy czynić z odpowiednią częstotliwością celem maksymalizacji prawdopodobieństwa wykrycia jakichkolwiek nieprawidłowości behawioralnych i/lub neurologicznych. Obserwacje najlepiej prowadzić o tej samej porze każdego dnia, biorąc pod uwagę szczytowy okres przewidywanych skutków po dawkowaniu. Częstotliwość obserwacji klinicznych i badań czynnościowych jest podana w tabeli B.43.2. Jeżeli dane kinetyczne i inne uzyskane w poprzednich badaniach wskazują na potrzebę zastosowania innych czasów obserwacji, badań lub okresów poobserwacyjnych, to należy przyjąć alternatywny schemat celem uzyskania maksimum możliwych obserwacji. Należy przedstawić uzasadnienie zmian schematu obserwacji.

1.6.1.1.   Obserwacje ogólnego stanu zdrowia i śmiertelności/zachorowalności

Wszystkie zwierzęta należy dokładnie obserwować pod względem stanu ich zdrowia przynajmniej raz dziennie, a także przynajmniej dwa razy dziennie pod względem śmiertelności i zachorowalności.

1.6.1.2.   Szczegółowe obserwacje kliniczne

Szczegółowe obserwacje kliniczne należy prowadzić dla wszystkich zwierząt wybranych do tego celu (zobacz tabela B.43.1) raz przed pierwszym narażeniem (by umożliwić dalsze porównania) i następnie w różnych odstępach w zależności od czasu trwania badania (zobacz tabela B.43.2). Szczegółowe obserwacje kliniczne w grupie satelitarnej należy prowadzić na koniec okresu rekonwalescencji. Szczegółowe obserwacje kliniczne należy prowadzić poza klatką w standardowych warunkach. Stosowane kryteria i skale punktowe powinny być wyraźnie określone przez laboratorium badawcze. Należy dołożyć starań, aby zmienność warunków doświadczalnych była minimalna (niezwiązana układowo z narażeniem) i by obserwacje były dokonywane przez wyszkolony personel nieznający poziomu narażenia zwierząt.
Zaleca się, aby obserwacje były prowadzone w sposób strukturalny o dobrze określonych kryteriach (wliczając definicję normalnego "zakresu"), które są systematycznie stosowane dla każdego zwierzęcia w każdym czasie obserwacji. "Normalny zakres" powinien być odpowiednio udokumentowany. Wszelkie zaobserwowane oznaki powinny być zapisane. Kiedy tylko jest to możliwe, notować także należy wielkość obserwowanych zmian. Obserwacje kliniczne powinny obejmować, ale nie ograniczać się do zmian na skórze, sierści, oczach, błonach śluzowych, występowaniu wydzielin i wydalin oraz objawów autonomicznych (łzawienie, stroszenie sierści, rozmiar źrenicy, nietypowy sposób oddychania i/lub oddychania ustami, oznaki nietypowego oddawania moczu i wydalania kału, zmiany zabarwienia moczu).
Notować należy wszelkie nietypowe reakcje dotyczące pozycji ciała, poziomu aktywności (np. zwiększenie lub zmniejszenie penetracji standardowego obszaru) i koordynacji ruchów. Zapisywać należy zmiany w chodzie (np. chód kaczkowaty, niezborność kończyn), postawie (np. zgrabiony grzbiet) i reakcji na traktowanie zwierząt lub inne bodźce otoczenia, a także pojawienie się ruchów tonicznych lub klonicznych, konwulsji lub drgawek, stereotypii (np. nadmierne czyszczenie się, niezwykłe ruchy głowy, krążenie w kółko) lub dziwaczne zachowanie się (np. kąsanie lub nadmierne lizanie się, samookaleczanie, chodzenie tyłem, wydawanie dźwięków) lub agresja.

1.6.1.3.   Badania czynnościowe

Podobnie do badań klinicznych badania czynnościowe należy przeprowadzić raz przed narażeniem i często w dalszej kolejności na wszystkich zwierzętach przeznaczonych do tego celu (zobacz tabela B.43.1). Częstotliwość badań czynnościowych jest także zależna od czasu trwania badania (zobacz tabela B.43.2). W uzupełnieniu okresów obserwacji ustalonych w tabeli B.43.2 obserwacje czynnościowe grup satelitarnych powinny być wykonane możliwie blisko terminu likwidacji zwierząt. Do badań czynnościowych zalicza się reaktywność czuciową na bodźce różnej modalności, np.: bodźce słuchowe, wizualne i proprioceptywne (zobacz pozycje 5, 6 i 7 piśmiennictwa), oszacowanie siły uścisku (zobacz pozycja 8 piśmiennictwa) i oszacowanie aktywności motorycznej (zobacz pozycja 9 piśmiennictwa). Aktywność motoryczna powinna być mierzona urządzeniem automatycznym zdolnym do wykrywania wzrostu i spadku aktywności. Jeżeli stosowany jest inny zdefiniowany system, to powinien on dawać wyniki ilościowe, a jego czułość i wiarygodność powinny być wykazane. Każde urządzenie powinno być sprawdzone celem zapewnienia powtarzalności w czasie i zgodności pomiędzy urządzeniami. Dalsze szczegóły co do postępowania podano w odpowiednich pozycjach piśmiennictwa. Jeżeli brak jest danych (np.: struktura-aktywność, dane epidemiologiczne, inne badania toksykologiczne) wykazujących możliwe skutki neurotoksyczne, to należy wziąć pod uwagę wykonanie bardziej specjalistycznych badań czynności sensorycznych i motorycznych lub uczenia się i zapamiętywania celem zbadania tych skutków bardziej szczegółowo. Więcej informacji na temat badań specjalistycznych i ich zastosowania podano w pozycji 1 piśmiennictwa.
W wyjątkowych sytuacjach zwierzęta wykazujące oznaki toksyczności w stopniu znacznie zakłócającym badania czynnościowe można wykluczyć z tych badań. Należy przedstawić uzasadnienie wykluczenia zwierząt z badań czynnościowych.

1.6.2.  Masa ciała i spożycie paszy/wody

W badaniach, które trwają do 90 dni, wszystkie zwierzęta powinny być ważone przynajmniej raz w tygodniu, a pomiary spożycia paszy (wody, gdy badana substancja podawana jest w tym nośniku) w odstępach przynajmniej tygodniowych. W przypadku badań długoterminowych wszystkie zwierzęta powinny być ważone przez pierwszych 13 tygodni raz w tygodniu i następnie przynajmniej co 4 tygodnie. Pomiary spożycia paszy (wody, gdy badana substancja podawana jest w tym nośniku) powinny być dokonywane przez pierwszych 13 tygodni raz w tygodniu i następnie w około 3-miesięcznych odstępach, chyba że stan zdrowia lub zmiany masy ciała sugerują inny sposób postępowania.

1.6.3.  Badania okulistyczne

W badaniach o czasie trwania dłuższym niż 28 dni badanie okulistyczne przy pomocy oftalmoskopu lub innego równorzędnego urządzenia powinno być wykonane przed podaniem badanej substancji i na koniec badania u wszystkich zwierząt lub, co najmniej u zwierząt otrzymujących najwyższą dawkę i zwierząt z grupy kontrolnej. Jeżeli wykryte zostaną zmiany w oczach lub jeżeli oznaki kliniczne wskazują na potrzebę badań, to wszystkie zwierzęta należy poddać takim badaniom. W przypadku badań długoterminowych badania należy także przeprowadzić po 13 tygodniach. Nie ma potrzeby prowadzenia badań okulistycznych, jeżeli takie wyniki są już dostępne z innych badań o podobnym czasie trwania i podobnych poziomach dawek.

1.6.4.  Hematologia i biochemia kliniczna

Gdy badanie neurotoksyczności jest wykonywane łącznie z ogólnoustrojowym badaniem toksyczności o powtarzanym dawkowaniu, to badania hematologiczne i biochemia kliniczna powinny być wykonane w odpowiednim czasie zgodnie z odpowiednią metodą badania toksyczności ogólnoustrojowej. Pobranie próbek powinno być wykonane w taki sposób, by zminimalizować jakiekolwiek potencjalne skutki neurobehawioralne.

1.6.5.  Badania histopatologiczne

Badanie neuropatologiczne powinno uzupełniać i rozszerzać obserwacje poczynione podczas fazy in vivo badania. Tkanki z przynajmniej 5 zwierząt/płeć/grupę (zobacz tabela B.43.1 i następny akapit) powinny być utrwalone in situ przy zastosowaniu ogólnie uznanych metody perfuzji i utrwalania (zobacz pozycja 3 rozdział 5 piśmiennictwa i pozycja 4 rozdział 50 piśmiennictwa). Zapisywać należy wszelkie zmiany makroskopowe. Gdy badanie jest wykonywane jako samodzielne lub w celu wykrycia neurotoksyczności lub określenia skutków neurotoksycznych, pozostałe zwierzęta mogą być użyte do badań neurobehawioralnych (zobacz pozycje 10 i 11 piśmiennictwa), neuropatologicznych (zobacz pozycje 10, 11, 12 i 13 piśmiennictwa), neurochemicznych (zobacz pozycje 10, 11, 14 i 15 piśmiennictwa) lub elektrofizjologicznych (zobacz pozycje 10, 11, 16 i 17 piśmiennictwa) uzupełniających procedury niniejszej metody lub do zwiększenia liczby zwierząt do badań histopatologicznych. Te procedury uzupełniające mają szczególne znaczenie, gdy obserwacje empiryczne lub przewidywane skutki wskazują na specyficzny rodzaj lub sposób działania neurotoksycznego (zobacz pozycje 2 i 3 piśmiennictwa). Pozostałe zwierzęta można także odpowiednio użyć do badań patologicznych opisanych w metodach z zastosowaniem powtarzanego dawkowania.
Wszystkie próbki tkanek należy wybarwić ogólnie stosowanymi technikami barwienia z wykorzystaniem hematoksyliny i eozyny (H&E), zatopić w parafinie i zbadać techniką mikroskopową. Jeżeli obserwuje się lub podejrzewa oznaki ogólnej neuropatii obwodowej, to należy badać próbki tkanki nerwu obwodowego zatopione w tworzywie sztucznym. Objawy kliniczne mogą także sugerować badania dodatkowych miejsc bądź też zastosowanie specjalnych technik barwienia. Wskazówki dotyczące badania innych miejsc można znaleźć w pozycjach 3 i 4 piśmiennictwa. Pomocne mogą być odpowiednie barwienia celem wykazania specyficznych rodzajów zmian patologicznych (zobacz pozycja 18 piśmiennictwa).
Reprezentatywne skrawki centralnego i obwodowego układu nerwowego powinny być badane histologicznie (zobacz pozycja 3 rozdział 5 piśmiennictwa i pozycja 4 rozdział 50 piśmiennictwa). Badane powinno być: przodomózgowie, część centralna mózgu, w tym przekrój przez podwzgórze, śródmóżdże, móżdżek, most, rdzeń przedłużony, oko z nerwem wzrokowym i siatkówką, rdzeń kręgowy z odcinka szyjnego i zgrubienia lędźwiowego, zwój górny nerwu błędnego, grzbietowe i brzuszne włókna nerwu błędnego, proksymalny nerw kulszowy, proksymalny nerw piszczelowy (przy kolanie), nerw piszczelowy mięśnia łydkowego. Sekcja rdzenia kręgowego i nerwu obwodowego powinna zawierać przekroje podłużne i poprzeczne. Szczególną uwagę należy zwrócić na unaczynienie układu nerwowego. Zbadać należy także próbkę mięśnia szkieletowego, w szczególności łydkowego. Uwagę należy także zwrócić na miejsca o strukturze komórkowej i włóknistej w centralnym i obwodowym układzie nerwowym, o których wiadomo, że szczególnie podlegają wpływom przez substancje neurotoksyczne.
Wskazówki dotyczące zmian neuropatologicznych typowych po narażeniu na substancję toksyczną można znaleźć w pozycjach 3, 4 piśmiennictwa. Zaleca się etapowe badanie próbek tkanek, gdzie wycinki uzyskane od zwierząt z grupy otrzymującej substancję w najwyższej dawce są najpierw porównywane z tymi uzyskanymi od zwierząt z grupy kontrolnej. Jeżeli nie obserwuje się zmian neuropatologicznych w wycinkach z tych grup, to dalsza analiza nie jest konieczna. Jeżeli w wycinkach uzyskanych od zwierząt z grupy otrzymującej substancję w najwyższej dawce obserwuje się zmiany, to próbki tkanek uzyskanych od zwierząt, które mogły podlegać potencjalnym wpływom substancji podawanej w dawkach pośrednich i najniższej, muszą zostać zakodowane i kolejno przebadane.
Jeżeli w badaniach jakościowych zostaną stwierdzone zmiany neuropatologiczne, to należy przeprowadzić drugie badanie we wszystkich miejscach układu nerwowego wykazujących te zmiany. Skrawki uzyskane od zwierząt otrzymujących substancje w dawkach na wszystkich badanych poziomach z każdego potencjalnie zmienionego regionu należy zakodować i zbadać losowo bez znajomości kodu. Należy zapisać częstość każdej zmiany i jej nasilenie. Po zbadaniu wszystkich regionów ze wszystkich grup otrzymujących substancje w różnych dawkach kod należy złamać i wykonać analizę statystyczną celem oszacowania zależności dawka-odpowiedź. Należy opisać przykłady różnych stopni nasilenia każdej zmiany.
Zmiany neuropatologiczne należy oceniać w kontekście obserwacji i pomiarów behawioralnych, a także innych danych z poprzednich i obecnego badania toksyczności substancji.

2. WYNIKI

2.1. Opracowanie wyników

Należy przedstawić wyniki dla poszczególnych zwierząt. Ponadto wszystkie dane należy zestawić w postaci tabelarycznej, wykazując dla każdej grupy i grupy kontrolnej liczbę zwierząt na początku doświadczenia, liczbę zwierząt martwych w trakcie badania lub uśmierconych w humanitarny sposób oraz czas ich padnięcia lub uśmiercenia, liczbę zwierząt wykazujących oznaki toksyczności, opis zaobserwowanych oznak toksyczności wraz z czasem ich pojawienia się, czasem trwania, rodzajem i nasileniem wszelkich skutków toksycznych, liczbą zwierząt wykazujących zmiany chorobowe wraz z ich rodzajem i nasileniem.

2.2. Oszacowanie i interpretacja wyników


Dane z badań należy wycenić pod względem występowania, nasilenia i korelacji skutków neurobehawioralnych i neuropatologicznych (neurochemicznych lub elektrofizjologicznych skutków także, jeżeli prowadzone były badania uzupełniające) oraz jakichkolwiek innych obserwowanych skutków. O ile to możliwe, to dane liczbowe powinny zostać poddane właściwej i ogólnie uznanej analizie statystycznej. Metody statystyczne należy dobrać na etapie projektowania doświadczenia.

3. SPRAWOZDANIE

Sprawozdanie powinno zawierać następujące informacje:
Badana substancja:
-   właściwości fizykochemiczne (w tym izomeryzacja, czystość),
-   dane identyfikacyjne.
Nośnik (o ile był stosowany):
-   uzasadnienie wyboru nośnika.
Zwierzęta doświadczalne:
-   stosowany gatunek/szczep,
-   liczba, wiek i płeć zwierząt,
-   źródło pochodzenia, warunki przetrzymywania, pasza itd.,
-   masy zwierząt (każde zwierzę oddzielnie) na początku doświadczenia.
Warunki przeprowadzania badania:
-   szczegóły dotyczące formulacji badanej substancji/przygotowania paszy, uzyskane stężenie, trwałość i jednorodność używanego preparatu,
-   podawane dawki, w tym dane dotyczące nośnika, jego objętości i stanu skupienia,
-   szczegóły podawania badanej substancji,
-   uzasadnienie wyboru dawek,
-   uzasadnienie sposobu podawania i czasu trwania narażenia,
-   przeliczenie stężenia badanej substancji w paszy/wodzie (ppm) na rzeczywistą dawkę (mg/kg masy ciała/dzień), gdy podawano w paszy/wodzie,
-   szczegóły dotyczące jakości paszy i wody.
Obserwacje i procedury badań:
-   szczegóły dotyczące przypisania poszczególnych zwierząt w każdej grupie do podgrup przeznaczonych do perfuzji,
-   szczegóły systemu punktacji wraz z kryteriami i skalą punktową dla każdego pomiaru w szczegółowych obserwacjach klinicznych,
-   szczegóły badań czynnościowych oddziaływania czuciowego na bodźce o różnej modalności (np.: słuchowe, wzrokowe, proprioceptywne); szacowanie siły chwytności, szacowanie aktywności ruchowej (wraz ze szczegółami z badań wykrywania aktywności urządzeniami automatycznymi) oraz inne stosowane procedury,
-   szczegóły badań okulistycznych i, o ile wykonywano, badań hematologicznych, biochemii klinicznej wraz z wartościami uzyskanymi u zwierząt z grupy kontrolnej,
-   szczegóły dotyczące poszczególnych procedur neurobehawioralnych, neuropatologicznych, neurochemicznych lub elektrofizjologicznych.
Wyniki:
-   masy ciała/zmiany masy ciała zwierząt także tych po uśmierceniu,
-   spożycie paszy i wody, o ile dotyczy,
-   dane dotyczące reakcji toksycznych według płci i poziomu dawkowania, w tym oznaki toksyczności lub śmiertelność,
-   charakter, nasilenie i czas trwania (czas pojawienia się i przebieg) szczegółowych obserwacji klinicznych (odwracalne czy nie),
-   szczegółowy opis wszystkich wykonanych badań czynnościowych,
-   wyniki badania sekcyjnego,
-   szczegóły wszelkich zmian neurobehawioralnych, neuropatologicznych, neurochemicznych lub elektrofizjologicznych,
-   dane o absorpcji i metabolizmie, o ile dostępne,
-   analiza statystyczna, gdy stosowano.
Dyskusja wyników:
-   zależność dawka-odpowiedź,
-   związek jakichkolwiek innych skutków toksycznych z wnioskiem o potencjale neurotoksycznym badanej substancji,
-   poziom dawki bez obserwowanego działania szkodliwego.
Wnioski:
-   określenie ogólnej neurotoksyczności badanej substancji.

4. PIŚMIENNICTWO

 1)   OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.
 2)   Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.
 3)   World Health Organization (WHO) (1986). Environmental Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.
 4)   Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/ London.
 5)   Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003.
 6)   Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.
 7)   Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., 108, 267-283.
 8)   Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233-236.
 9)   Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599-609.
 10)  Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.
 11)  Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker, New York.
 12)  Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689-695.
 13)  Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. (1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydroxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, 343-352.
 14)  O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445-452.
 15)  O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368-378.
 16)  Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Electrophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp. 299-335.
 17)  Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neurotoxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co.,. Baltimore/London, pp. 726-742.
 18)  Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.

Tabela B.43.1:

Minimalne liczby zwierząt w grupie, gdy badanie neurotoksyczności wykonuje się oddzielnie lub w kombinacji z innymi badaniami

	BADANIE NEUROTOKSYCZNOŚCI PROWADZONE JAKO:
	Oddzielne badania	Badanie łączone z testem 28-dniowym	Badanie łączone z testem 90-dniowym	Badanie łączone z testem przewlekłym
Całkowita liczba zwierząt w grupie	10 samców i 10 samic	10 samców i 10 samic	15 samców i 15 samic	25 samców i 25 samic
Liczba zwierząt przeznaczonych do badań czynnościowych wraz z obserwacjami klinicznymi	10 samców i 10 samic	10 samców i 10 samic	10 samców i 10 samic	10 samców i 10 samic
Liczba zwierząt przeznaczonych do perfuzji in situ i neurohistopatologii	5 samców i 5 samic	5 samców i 5 samic	5 samców i 5 samic	5 samców i 5 samic
Liczba zwierząt przeznaczonych do powtarzanego dawkowania/obserwacji toksyczności podprzewlekłej/przewlekłej, hematologii, biochemii klinicznej, histopatologii itp., jak wykazano w odpowiednich Wytycznych		5 samców i 5 samic	10 samców* i 10 samic*	20 samców* i 20 samic*

* W tym pięć zwierząt przeznaczonych do badań czynnościowych i szczegółowych obserwacji klinicznych jako część badania neurotoksyczności.

Tabela B.43.2:

Częstotliwość obserwacji klinicznych i badań czynnościowych

Rodzaj obserwacji	Czas trwania badania
		ostre	28-dniowe	90-dniowe	przewlekłe
u wszystkich zwierząt	ogólny stan zdrowotny	codziennie	codziennie	codziennie	codziennie
	śmiertelność/ zachorowalność	dwa razy dziennie	dwa razy dziennie	dwa razy dziennie	dwa razy dziennie
U zwierząt przeznaczonych do obserwacji czynnościowych	Szczegółowe obserwacje kliniczne	- przed pierwszym narażeniem - w ciągu 8 godzin po podaniu w przewidywanym okresie szczytowym - w 7 i 14 dniu po podaniu	- przed pierwszym narażeniem - następnie co tydzień	- przed pierwszym narażeniem - raz w pierwszym lub drugim tygodniu narażenia - następnie co miesiąc	- przed pierwszym narażeniem - raz pod koniec pierwszego miesiąca narażenia - następnie co trzy miesiące
	Badania czynnościowe	- przed pierwszym narażeniem - w ciągu 8 godzin po podaniu w przewidywanym okresie szczytowym - w 7 i 14 dniu po podaniu	- przed pierwszym narażeniem - w ciągu 4 tygodni narażenia możliwie najbliżej okresu narażenia	- przed pierwszym narażeniem - raz w pierwszym lub drugim tygodniu narażenia - następnie co miesiąc	- przed pierwszym narażeniem - raz pod koniec pierwszego miesiąca narażenia - następnie co trzy miesiące

ZAŁĄCZNIK Nr 11

C.21. MIKROORGANIZMY GLEBOWE: BADANIE PRZEMIAN AZOTU

1. METODA

Niniejsza metoda jest równoważna metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 216 (2000).

1.1. Wstęp

Niniejsza metoda opisuje laboratoryjną metodę badawczą służącą do oceny długoterminowego wpływu substancji chemicznych, po jednorazowym narażeniu, na aktywność mikroorganizmów glebowych w przemianach azotu. Badanie opiera się głównie na zaleceniach Europejskiej i Śródziemnomorskiej Organizacji Ochrony Roślin (zobacz pozycja 1 piśmiennictwa). Uwzględnione zostały również inne wytyczne, takie jak niemieckie Biologicznego Urzędu Federalnego (zobacz pozycja 2 piśmiennictwa), amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska US EPA (zobacz pozycja 3 piśmiennictwa), SETAC (zobacz pozycja 4 piśmiennictwa) oraz Międzynarodowej Organizacji Standaryzacji ISO (zobacz pozycja 5 piśmiennictwa). Podczas posiedzenia OECD na temat wyboru gleby/osadu w Belgirate, Włochy w 1995 r. (zobacz pozycja 6 piśmiennictwa), uzgodniono liczbę i rodzaj gleby, które można zastosować w badaniach wykonanych wg niniejszej metody. Zalecenia w zakresie pobierania, opracowania i przechowywania próbek glebowych, opierają się na Dokumencie Przewodnim ISO (zobacz pozycja 7 piśmiennictwa) oraz na ustaleniach podjętych podczas spotkania roboczego w Belgirate. Podczas określania i szacowania charakterystyki toksykologicznej badanych substancji konieczne może okazać się oznaczenie ich wpływu na aktywność mikroorganizmów glebowych, np.: gdy wymagane są dane dotyczące potencjalnych skutków ubocznych środków ochrony roślin na mikroflorę glebową lub gdy spodziewane jest narażenie mikroorganizmów glebowych na substancje chemiczne inne niż środki ochrony roślin. Badanie przemian azotu wykonuje się w celu określenia wpływu takich substancji chemicznych na mikroflorę glebową. Podczas badania agrochemikaliów (środki ochrony roślin, nawozy, chemikalia stosowane w leśnictwie) wykonuje się zarówno badanie przemian azotu, jak i badanie przemian węgla. Przy badaniach innych substancji wystarczające jest badanie przemian azotu. Jeżeli jednak wartość EC50 w badaniu przemian azotu dla takich substancji znajduje się w tym samym zakresie jak dla handlowo dostępnych inhibitorów procesu nitryfikacji (np. nitrapyrina), to w celu zebrania dalszych informacji powinno być wykonane badanie przemian węgla.
Gleby składają się z żywych i nieożywionych składników, które istnieją w złożonych i heterogenicznych mieszaninach. Mikroorganizmy odgrywają ważną rolę w rozkładzie i przemianach materii organicznej w żyznych glebach, z wieloma gatunkami mającymi wkład w różne aspekty użyźnienia gleby. Długoterminowe zakłócenie tych procesów biochemicznych może potencjalnie oddziaływać na krążenie składników odżywczych i poprzez to zmieniać żyzność gleby. Przemiany azotu i węgla następują we wszystkich żyznych glebach. Chociaż zespoły mikroorganizmów odpowiedzialne za te procesy różnią się między glebami, to szlaki przemian są zasadniczo takie same.
Badanie opisane w niniejszej metodzie ma służyć wykrywaniu długoterminowych szkodliwych wpływów substancji na proces przemiany azotu w aerobowych glebach powierzchniowych. Metoda badawcza pozwala także na oszacowanie wpływów substancji na przemiany węgla przez mikroflorę glebową. Powstawanie azotanów ma miejsce w następstwie rozpadu wiązań węgiel-azot. Dlatego też, jeżeli w glebach kontrolnych i badanych znajduje się równe ilości wytwarzanych azotanów, to wysoce prawdopodobny jest fakt, że główne szlaki przemian węgla są nienaruszone i funkcjonalne. Substrat wybrany do badania (sproszkowana lucerna) ma korzystny stosunek węgla do azotu (zazwyczaj pomiędzy 12:1 i 16:1). Z tego powodu zredukowany jest niedobór węgla w czasie badania i jeżeli zespoły mikroorganizmów są zniszczone przez substancję chemiczną, to mogą się one odrodzić w ciągu 100 dni.
Badanie, z którego wywodzi się niniejsza metoda badawcza, było pierwotnie zaprojektowane dla substancji, których ilość w glebie można było przewidzieć. Tak jest na przykład w przypadku środków ochrony roślin, dla których znana jest ich ilość stosowana w polu. W przypadku agrochemikaliów wystarczające jest badanie dwóch dawek, jakie przewiduje się lub przypuszcza, że będą stosowane. Agrochemikalia mogą być badane jako substancje aktywne (s.a.) lub w postaci gotowych form użytkowych. Jednakże niniejsze badanie nie ogranicza się tylko do agrochemikaliów. Zmieniając zarówno ilość badanej substancji stosowanej do gleby, jak i sposób opracowania danych, badanie może być również wykonane w przypadku substancji chemicznych, w stosunku do których nie jest znana spodziewana ich ilość w glebie. Dlatego dla substancji innych niż agrochemikalia oznacza się wpływ serii stężeń na przemiany azotu. Dane z tych badań używane są do wyznaczenia krzywej zależności dawka-odpowiedź i wyliczenia wartości ECx, gdzie x jest zdefiniowanym % skutku.

1.2. Definicje

Przemiany azotu: to rozkład przez mikroorganizmy materii organicznej zawierającej azot poprzez procesy amonifikacji i nitryfikacji do odpowiedniego nieorganicznego azotanowego produktu końcowego.
ECx (Stężenie efektywne): jest stężeniem badanej substancji w glebie powodującym x procent inhibicji przemian azotu do azotanów.
EC50 (Medialne stężenie efektywne): jest stężeniem badanej substancji w glebie powodującym 50 % inhibicję przemian azotu do azotanów.

1.3. Substancje kontrolne

Brak.

1.4. Zasada metody badawczej

Do przesianej gleby dodaje się sproszkowany substrat roślinny, a próbkę poddaje się działaniu badanej substancji lub pozostawia bez dodatku badanej substancji (badanie kontrolne). Jeżeli badane są agrochemikalia, to zaleca się minimum dwa stężenia, które powinny być wybrane w odniesieniu do najwyższego stężenia, jakie przewiduje się w warunkach polowych. Po 0, 7, 14 i 28 dniach inkubacji próbki gleby badanej i kontrolnej są poddawane ekstrakcji z odpowiednim rozpuszczalnikiem i w ekstraktach oznacza się ilości azotanów. Ilość wytworzonych azotanów w próbkach badanych jest porównywana z wartością w próbkach kontrolnych. Następnie oblicza się procent odchylenia w stosunku do gleby kontrolnej. Wszystkie badania prowadzone są przez przynajmniej 28 dni. Jeżeli 28 dnia różnica między próbkami kontrolnymi i badanymi jest równa lub większa niż 25 %, to pomiary kontynuowane są maksymalnie 100 dni. Jeżeli badane są substancje inne niż agrochemikalia, to do próbek gleby dodaje się badaną substancję w stężeniach stanowiących serię, a ilości azotanów w próbce kontrolnej i próbkach badanych oznacza się po 28 dniach inkubacji. Wyniki badań z wieloma stężeniami analizowane są przy pomocy modelu regresji. Wyliczane są wartości ECx (np.: EC50, EC25 i/lub EC10).

1.5. Wiarygodność badania

Szacowanie wyników badania dla agrochemikaliów opiera się na stosunkowo małych różnicach (tj. średnia wartość (25 %) pomiędzy stężeniami azotanów w próbkach kontrolnych i próbkach badanych, więc duże odchylenia w grupie kontrolnej mogą prowadzić do fałszywych wyników. Dlatego zmienność pomiędzy powtórzeniami w grupie kontroli powinna wynosić mniej niż ±15 %.

1.6. Opis metody badawczej

1.6.1.  Wyposażenie

W badaniu stosuje są naczynia wykonane z obojętnego chemicznie materiału. Powinny być one odpowiedniej wielkości w zależności od zastosowanej procedury inkubacji gleb, tj. inkubacji całej partii gleby lub jako seria poszczególnych próbek glebowych (zobacz pkt 1.7.1.2). Należy poczynić starania, by zminimalizować straty wody z jednej strony, a z drugiej by umożliwić wymianę gazową podczas badania (np.: naczynia stosowane w badaniu mogą być przykryte perforowaną folią polietylenową). Gdy badane są substancje lotne, powinny być stosowane szczelne i nieprzepuszczalne dla gazu naczynia. Powinny one mieć takie rozmiary, aby próbka gleby wypełniała w przybliżeniu jedną czwartą ich objętości.
Stosowane jest standardowe wyposażenie laboratoryjne:
-   urządzenie wytrząsające: wytrząsarka mechaniczna lub inne odpowiednie,
-   wirówka (3.000 g) lub urządzenie do filtracji (z wykorzystaniem filtrów papierowych wolnych od azotanów),
-   urządzenie o odpowiedniej czułości i powtarzalności do analizy azotanów.

1.6.2.  Wybór i liczba gleb

Powinno stosować się glebę jednego rodzaju. Zaleca się stosować glebę o następującej charakterystyce:
-   zawartość piasku: nie mniej niż 50 % i nie więcej niż 75 %,
-   wartość pH: 5,5-7,5,
-   zawartość węgla organicznego: 0,5-1,5 %,
-   biomasa mikroorganizmów powinna być oznaczona (zobacz pozycje 8 i 9 piśmiennictwa), a zawartość węgla powinna stanowić przynajmniej 1 % całkowitego węgla organicznego gleby.
Najczęściej gleba o takiej charakterystyce jest najbardziej niekorzystnym przypadkiem, ponieważ adsorpcja badanej substancji jest minimalna, a jej dostępność dla mikroflory maksymalna. Dlatego też badania z innymi glebami są w zasadzie niepotrzebne. Jednakże w pewnych okolicznościach, np. gdy przewidywane zastosowanie badanej substancji będzie miało miejsce na szczególnych glebach, takich jak kwaśne gleby leśne, lub w przypadku substancji chemicznych naładowanych elektrostatycznie, konieczne może się okazać zastosowanie dodatkowej gleby.

1.6.3.  Pobieranie i przechowywanie próbek gleby

1.6.3.1.   Pobieranie próbek gleby

Dostępne powinny być szczegółowe informacje dotyczące historii miejsca, z którego pobierana jest gleba do badań. Podać należy dokładne miejsce, rodzaj roślinności pokrywającej, daty zastosowania środków ochrony roślin, zastosowanie nawozów organicznych i nieorganicznych, dodatki materiałów biologicznych lub przypadkowe zanieczyszczenia. Miejsce, z którego pobiera się próby gleby do badań, powinno być tak dobrane, aby umożliwić długoterminowe jego użycie. Odpowiednie są pastwiska stale wypasane, pola uprawne z jednorocznymi uprawami zbóż (z wyjątkiem kukurydzy) lub gęsto zasiane zielone łąki. Miejsce wybrane do pobierania próbek nie powinno być poddawane zabiegom z użyciem środków ochrony roślin przez minimum jeden rok przed pobraniem próbek. Ponadto przez przynajmniej sześć miesięcy przed pobieraniem prób nie powinno stosować się żadnego nawozu organicznego. Zastosowanie nawozu mineralnego jest możliwe tylko w przypadku wymagania tego przez rośliny uprawne, a próbki gleby nie powinny być pobierane wcześniej niż trzy miesiące po zastosowaniu nawozu. Należy unikać wykorzystywania gleb, na których stosowano nawozy o znanych skutkach działania biobójczego (np. cyjanamid wapnia).
Należy unikać pobierania próbek podczas lub tuż po długich okresach suszy (dłuższe niż 30 dni) lub spływów wody. W przypadku gleb ornych próbki należy pobierać z głębokości 0 do 20 cm. W przypadku łąk (pastwisk) lub innych gleb, gdzie orka nie była przeprowadzana przez długie okresy (przynajmniej jeden sezon), maksymalna głębokość pobierania próbek może wynosić nieco więcej niż 20 cm (np. do 25 cm). Próbki gleby powinny być transportowane w pojemnikach i temperaturze, które gwarantują, że pierwotne właściwości gleby nie zostaną znacząco zmienione.

1.6.3.2.   Przechowywanie próbek gleby

Najbardziej właściwe jest stosowanie gleby świeżo pobranej z pola. Jeżeli jednak nie ma sposobu na uniknięcie przechowywania w laboratorium, to gleby mogą być przechowywane w ciemności w temperaturze 4±2 °C przez maksimum trzy miesiące. Podczas przechowywania gleby należy zapewnić warunki tlenowe. Jeżeli gleby pobiera się z miejsc, gdzie są one zamarznięte przez przynajmniej trzy miesiące w roku, to można rozważyć ich przechowywanie przez sześć miesięcy w temperaturze od -18 °C do -22 °C. Biomasę mikroorganizmów w przechowywanych glebach oznacza się przed każdym doświadczeniem. Węgiel w biomasie powinien stanowić przynajmniej 1 % całkowitego węgla organicznego (zobacz pkt 1.6.2).

1.6.4.  Obróbka i przygotowanie gleby przed badaniem

1.6.4.1.   Inkubacja wstępna

Jeżeli gleba była przechowywana (zobacz pkt 1.6.3.2), zaleca się inkubację wstępną przez odpowiedni okres wynoszący od 2 do 28 dni. Temperatura i wilgotność gleby podczas inkubacji wstępnej powinny być podobne do tych stosowanych w badaniu (zobacz pkt 1.6.4.2. i pkt 1.7.1.3).

1.6.4.2.   Parametry fizykochemiczne

Glebę oczyszcza się ręcznie z dużych zanieczyszczeń (np. kamieni, części roślin) i następnie przesiewa do cząstek o rozmiarach równych lub mniejszych niż 2 mm. Wilgotność gleby powinna być dostosowana za pomocą wody destylowanej lub dejonizowanej do wartości pomiędzy 40 i 60 % maksymalnej pojemności wodnej.

1.6.4.3.   Dodanie substratu organicznego

Do gleby należy dodać odpowiedni substrat organiczny, np. sproszkowaną lucernę (główny składnik: Medicago sativa), w którym stosunek C:N zawarty jest pomiędzy 12:1 a 16:1. Zaleca się stosować 5 g lucerny na kilogram gleby (sucha masa).

1.6.5.  Przygotowanie badanej substancji w celu dodania do gleby

Badaną substancję podaje się z nośnikiem. Nośnikiem może być woda (dla substancji rozpuszczalnych w wodzie) lub obojętna stała substancja, taka jak drobny piasek kwarcowy (rozmiar cząstek: 0,1-0,5 mm). Należy unikać stosowania płynnych nośników innych niż woda (np.: rozpuszczalniki organiczne, takie jak aceton, chloroform), ponieważ mogą one zniszczyć mikroflorę. Jeżeli jako nośnik stosuje się piasek, to może on zawierać badaną substancję rozpuszczoną lub zawieszoną w odpowiednim rozpuszczalniku. W takich przypadkach rozpuszczalnik powinien być usunięty przez odparowanie przed wymieszaniem z glebą. Dla równomiernego rozprowadzenia badanej substancji w glebie zaleca się stosowanie 10 g piasku na kilogram gleby (sucha masa). Do próbek kontrolnych dodaje się taką samą ilość wody i/lub piasku.
Badając substancje lotne należy, na tyle na ile to możliwe, unikać strat podczas ich wprowadzania, a także należy poczynić starania, by w sposób jednorodny rozprowadzić substancję w glebie (np. substancja powinna zostać podana do gleby w kilku miejscach).

1.6.6.  Stężenia substancji badanej

Jeżeli badane są agrochemikalia, to powinny być zastosowane przynajmniej dwa stężenia. Niższe stężenie powinno odpowiadać przynajmniej maksymalnej ilości substancji, jakiej można się spodziewać w glebie w warunkach praktycznych, natomiast wyższe stężenie powinno być wielokrotnością stężenia niższego. Stężenia badanej substancji dodanej do gleby oblicza się przy założeniu jednorodnego rozmieszczenia do głębokości 5 cm i gęstości gleby 1,5. W przypadku agrochemikaliów stosowanych bezpośrednio do gleby lub dla substancji chemicznych, których ilość w glebie można przewidzieć, zalecane stężenia badane to maksymalne Przewidywane Stężenie w Środowisku (PEC) i jego pięciokrotność. W przypadku substancji, które stosuje się kilkakrotnie w czasie sezonu, badane stężenia wyznacza się, mnożąc PEC przez maksymalną przewidywaną liczbę stosowań. Jednakże najwyższe stosowane stężenie nie powinno przekraczać dziesięciokrotności maksymalnej jednorazowo zastosowanej dawki. Jeżeli badane są substancje inne niż agrochemikalia, należy stosować serię pięciu stężeń w postępie geometrycznym. Badane stężenia powinny obejmować zakres konieczny do wyznaczenia wartości ECx.

1.7. Wykonanie badania

1.7.1.  Warunki narażenia

1.7.1.1.   Stężenia substancji badanej i kontrola

Jeżeli badane są agrochemikalia, badaną próbkę gleby dzieli się na trzy części o równej masie. Dwie części miesza się z nośnikiem zawierającym badany produkt, a trzecią część miesza się z nośnikiem bez badanego produktu (kontrola). Zaleca się stosowanie minimum trzech powtórzeń dla stężeń i kontroli. W przypadku badania substancji innych niż agrochemikalia glebę dzieli się na sześć części o równej masie. Pięć z nich miesza się z nośnikiem zawierającym badaną substancję, a szóstą miesza się z nośnikiem bez badanej substancji. Zarówno dla kontroli, jak i badanych serii stężeń zaleca się prowadzenie trzech powtórzeń. Należy podjąć wszelkie starania w celu zapewnienia jednorodnego rozprowadzenia badanej substancji w próbkach gleby. Podczas mieszania należy unikać ubijania i zgniatania gleby.

1.7.1.2.   Inkubacja próbek glebowych

Inkubacja próbek glebowych może być przeprowadzona na dwa sposoby: całej partii gleby z badaną substancją i gleby kontrolnej lub z wykorzystaniem równych części poszczególnych próbek gleby kontrolnej i z badaną substancją. Jeżeli inkubuje się całe partie gleby, to należy przygotować dużą ilość próbek kontrolnych i z badaną substancją, żeby podczas badania pobierać z nich małe próbki do analizy. Wyjściowa masa przygotowanej gleby pierwotnej i w stężeniach zależy od rozmiaru próbek pobieranych do analizy, liczby zastosowanych powtórzeń w analizie oraz przewidywanej maksymalnej krotności pobierania. Gleby inkubowane w całości przed pobieraniem próbek do analizy powinny zostać dobrze wymieszane. Jeżeli gleby są inkubowane jako poszczególne próbki, to każda z nich, zarówno kontrolna, jak i z badaną substancją dzielona jest na wymaganą liczbę mniejszych próbek i te są wykorzystywane według potrzeby. W doświadczeniach, gdzie przewiduje się więcej niż dwa pobrania próbek do analizy, mniejsze próbki powinny być przygotowane w ilości wystarczającej dla wszystkich powtórzeń we wszystkich punktach czasowych pobierania próbek. Powinny być inkubowane przynajmniej trzy powtórzenia badanej gleby w warunkach tlenowych (zobacz pkt 1.7.1.1). Podczas wszystkich badań stosowane powinny być odpowiednie pojemniki o powierzchni pozwalającej na uniknięcie rozwoju warunków beztlenowych. Jeżeli badane są substancje lotne, badania należy prowadzić z serią poszczególnych próbek.

1.7.1.3.   Warunki i czas trwania badania

Badanie jest wykonywane w ciemności w temperaturze pokojowej 20±2 °C. Wilgotność próbek gleby powinna być utrzymywana w czasie badania pomiędzy 40 % a 60 % maksymalnej pojemności wodnej gleby (zobacz pkt 1.6.4.2) z odchyleniem ±5 %. W miarę potrzeby można dodać wodę destylowaną lub dejonizowaną.
Minimalny czas trwania badania wynosi 28 dni. Jeżeli badane są agrochemikalia, to porównywane są ilości wytworzonych azotanów w próbkach kontrolnych i z badaną substancją. Jeżeli po 28 dniach różnią się one o więcej niż 25 %, to badanie jest kontynuowane aż osiągnie się różnicę równą lub mniejszą niż 25 % lub przez maksimum 100 dni w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Dla substancji innych niż agrochemikalia badanie kończy się po 28 dniach. Po 28 dniach w próbkach kontrolnych i próbkach gleby z badaną substancją oznacza się ilość azotanów i oblicza wartości ECx.

1.7.2.  Pobieranie próbek i analiza gleb

1.7.2.1.   Terminy pobierania próbek gleby

Jeżeli bada się agrochemikalia, to próbki gleby do analizy azotanów pobiera się w 0, 7, 14 i 28 dniu. Jeżeli konieczne jest przedłużenie badania, dalsze pomiary powinno wykonywać się w odstępach 14-dniowych.
Jeżeli bada się substancje inne niż agrochemikalia, to należy stosować przynajmniej pięć stężeń, a próbki gleby badać na zawartość azotanów na początku (dzień 0) i na koniec okresu narażenia (28 dzień). Dodatkowy pomiar, np. w 7 dniu, może być również wykonany, jeżeli zostanie to uznane za konieczne. Dane otrzymane w 28 dniu są używane do wyznaczenia wartości ECx dla substancji chemicznej. Jeżeli jest to wymagane, to dane z próbek kontrolnych z dnia 0 mogą zostać wykorzystane do podania początkowej ilości azotanów w glebie.

1.7.2.2.   Analiza próbek glebowych

Ilość wytworzonych azotanów w każdym powtórzeniu próbek z badaną substancja i glebie kontrolnej oznacza się za każdym razem podczas pobierania próbek. Azotany ekstrahuje się z gleby przez wytrząsanie z odpowiednim rozpuszczalnikiem, np. 0,1 M roztworem chlorku potasu. Zaleca się stosowanie 5 ml roztworu KCl na gram suchej masy gleby. W celu optymalizacji ekstrakcji naczynia zawierające glebę do ekstrakcji i roztwór ekstrakcyjny powinny być napełnione nie więcej niż do połowy. Mieszaniny wytrząsa się przez 60 minut, przy prędkości 150 obrotów na minutę. Mieszaniny odwirowywuje się lub filtruje. Fazy ciekłe analizuje się na zawartość azotanów. Ekstrakty wolne od cząsteczek mogą być przechowywane przed analizą w temperaturze minus 20±5 °C do sześciu miesięcy.

2. WYNIKI

2.1. Obliczanie wyników

Jeżeli badanie wykonuje się z agrochemikaliami, to ilość wytworzonych azotanów w każdej podwójnej próbce powinna być zapisana, a średnie wartości ze wszystkich powtórzeń powinny zostać zestawione w formie tabeli. Przemiany azotu powinny zostać oszacowane za pomocą odpowiedniej i ogólnie uznanej metody statystycznej (np. test F, poziom istotności 5 %). Ilości wytworzonego azotanu wyraża się w mg azotanu/kg suchej masy gleby/dzień. Ilość wytworzonego azotanu w każdym stężeniu porównuje się z ilością w glebie kontrolnej i obliczany jest procent odchylenia względem kontroli.
Jeżeli badanie wykonywane jest dla substancji innych niż agrochemikalia, to określa się ilość wytworzonych azotanów w każdym powtórzeniu i dla oszacowania wartości ECx wyznacza się krzywą zależności dawka-odpowiedź. Ilości azotanów (tj. mg azotanu/kg suchej masy gleby) oznaczonych w próbkach traktowanych po 28 dniach porównuje się z próbkami kontrolnymi. Z tych danych oblicza się procent inhibicji dla każdego stężenia. Wartości wyrażone w procentach należy korelować z odpowiednimi stężeniami. Procedury statystyczne powinny umożliwić obliczenie wartości ECx. Przy zastosowaniu standardowych procedur (zobacz pozycje 10, 11 i 12 piśmiennictwa) dla obliczonych wartości ECx wyznacza się także przedziały ufności (p=0,95).
Badane substancje, które zawierają duże ilości azotu, mogą spowodować wzrost ilości azotanów wytwarzanych w czasie badania. Jeżeli takie substancje badane są w wysokich stężeniach (np. substancje stosowane wielokrotnie), to w badaniu musi zostać zastosowana właściwa kontrola (tj. gleba plus badana substancja, ale bez substratu roślinnego). Dane z takiej kontroli należy uwzględnić w obliczeniach wartości ECx.

2.2. Interpretacja wyników

Jeżeli szacuje się wyniki z badania agrochemikaliów, a różnica w ilości wytworzonych azotanów pomiędzy niższą dawką (tj. maksymalnym przewidywanym stężeniem w środowisku) a dawką stosowaną w badaniu kontrolnym jest równa lub niższa niż 25 % w jakimkolwiek czasie pobierania próbki po 28 dniu, to produkt może zostać scharakteryzowany jako niemający długoterminowego wpływu na przemiany azotu w glebie. Przy szacowaniu wyników z badań substancji innych niż agrochemikalia stosuje się wartości EC50, EC25 i/lub EC10.

3. SPRAWOZDANIE

Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:
Dokładna identyfikacja stosowanej gleby:
-   umiejscowienie geograficzne (długość, szerokość),
-   informacje o historii miejsca (tj. rodzaj roślinności pokrywającej, zastosowane środki ochrony roślin, nawozy, przypadkowe zanieczyszczenia),
-   zastosowanie gleby (gleba rolnicza, leśna, itp.),
-   głębokość pobierania gleby (cm),
-   zawartość piasku/iłu/gliny (% suchej masy),
-   wartość pH (w wodzie),
-   zawartość węgla organicznego (% suchej masy),
-   zawartość azotu (% suchej masy),
-   początkowe stężenie azotanów (mg azotanów/kg suchej masy),
-   zdolność wymiany jonowej (mmol/kg),
-   biomasa mikroorganizmów wyrażona w procentach całkowitej zawartości węgla organicznego,
-   metody stosowane do oznaczenia każdego parametru,
-   wszystkie informacje dotyczące pobierania i przechowywania próbek,
-   szczegóły dotyczące wstępnej inkubacji gleby.
Badana substancja:
-   postać fizyczna i istotne właściwości fizykochemiczne,
-   nazwa chemiczna oraz wzór strukturalny, czystość (tj. dla środków ochrony roślin procentowa zawartość substancji aktywnej), zawartość azotu.
Substrat:
-   źródło substratu,
-   skład (tj. lucerna, lucerna - trawa),
-   zawartość węgla i azotu (% suchej masy),
-   rozmiar sita (mm).
Warunki badania:
-   szczegóły dotyczące wzbogacenia gleby substratem organicznym,
-   liczba stężeń badanej substancji i uzasadnienie wyboru stężeń,
-   szczegóły dotyczące sposobu podania badanej substancji do gleby,
-   temperatura inkubacji,
-   wilgotność gleby na początku i podczas trwania badania,
-   zastosowana metoda inkubacji gleby (cała partia gleby czy jako seria poszczególnych próbek gleby),
-   liczba powtórzeń,
-   informacja o tym, ile razy pobierano próbki,
-   metoda stosowana do ekstrakcji azotanów z gleby.
Wyniki:
-   procedura analityczna i sprzęt stosowany do analizy azotanów,
-   dane zawierające poszczególne wyniki i wartości średnie pomiarów azotanów w postaci tabeli,
-   odchylenia pomiędzy powtórzeniami w próbkach narażanych i kontrolnych,
-   wyjaśnienia poprawek w obliczeniach, jeżeli konieczne,
-   odchylenia w wytwarzaniu azotanów w każdym czasie pobierania próbek wyrażone w procentach lub w postaci wartości EC50 z 95 % przedziałami ufności, inne wartości ECx (tj. EC25 lub EC10) z przedziałami ufności oraz wykres krzywej zależności dawka-odpowiedź,
-   statystyczne opracowanie wyników,
-   wszystkie informacje i obserwacje pomocne w interpretacji wyników.

4. PIŚMIENNICTWO

 1)   EPPO (1994). Decision - Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
 2)   BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
 3)   EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed Rule. September 28, 1987.
 4)   SETAC - Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC - Europe, Brussels.
 5)   ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality - Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality - Biological Methods. PN-ISO 14238:2000 Jakość gleby - Metody biologiczne - Oznaczanie mineralizacji azotu i nitryfikacji w glebach oraz wpływu związków chemicznych na te procesy.
 6)   OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
 7)   ISO 10381-6 (1993). Soil quality - Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. PN-ISO 10381-6:1998 Jakość gleby - Pobieranie próbek - Zasady dotyczące pobierania, postępowania z próbkami i przechowywania próbek gleby przeznaczonych do badania tlenowych (aerobowych) procesów mikrobiologicznych w warunkach laboratoryjnych.
 8)   ISO 14240-1 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate - induced respiration method. PN-ISO 14240- 1:2001 Jakość gleby - Oznaczanie ilości biomasy mikroorganizmów w glebie - Metoda indukcji oddychania przez dodanie substratu.
 9)   ISO 14240-2 (1997). Soil quality - Determination of microbial biomass - Part 2: Fumigation - extraction method. PN-ISO 14240-2:2001 Jakość gleby - Oznaczanie ilości biomasy mikroorganizmów w glebie - Metoda fumigacji - ekstrakcji.
 10)  Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose - effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
 11)  Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.
 12)  Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.

ZAŁĄCZNIK Nr 12

C.22. MIKROORGANIZMY GLEBOWE: BADANIE PRZEMIAN WĘGLA

1. METODA

Niniejsza metoda jest równoważna metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 217 (2000).

1.1. Wstęp

Niniejsza metoda badawcza opisuje laboratoryjną metodykę służącą do badania długoterminowych wpływów środków ochrony roślin i innych substancji chemicznych, po jednorazowym narażeniu, na aktywność mikroorganizmów glebowych w przemianach węgla. Badanie opiera się głównie na zaleceniach Europejskiej i Śródziemnomorskiej Organizacji Ochrony Roślin (zobacz pozycja 1 piśmiennictwa). Brano również pod uwagę inne wytyczne, takie jak niemieckiego Biologicznego Urzędu Federalnego (zobacz pozycja 2 piśmiennictwa), amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska US EPA (zobacz pozycja 3 piśmiennictwa) oraz SETAC (zobacz pozycja 4 piśmiennictwa). Podczas posiedzenia OECD na temat wyboru gleby/osadu w Belgirate, Włochy w 1995 r. (zobacz pozycja 5 piśmiennictwa), uzgodniono liczbę i rodzaj gleby, które można zastosować w badaniach wykonanych wg niniejszej metody. Zalecenia co do pobierania, obróbki i przechowywania próbek glebowych opierają się na Dokumencie Przewodnim ISO (zobacz pozycja 6 piśmiennictwa) oraz na ustaleniach podjętych podczas spotkania roboczego w Belgirate.
Podczas określania i oceny charakterystyki toksykologicznej badanych substancji konieczne może okazać się oznaczenie ich wpływów na aktywność mikroorganizmów glebowych, np. gdy wymagane są dane dotyczące potencjalnych skutków ubocznych działania środków ochrony roślin na mikroflorę glebową lub gdy spodziewane jest narażenie mikroorganizmów glebowych na substancje chemiczne inne niż środki ochrony roślin. Badanie przemian węgla wykonuje się, aby określić wpływy takich substancji chemicznych na mikroflorę glebową. Podczas badania agro-chemikaliów (środki ochrony roślin, nawozy, chemikalia stosowane w leśnictwie) wykonuje się zarówno badanie przemian węgla, jak i badanie przemian azotu. Przy badaniach innych substancji wystarczające jest badanie przemian azotu. Jeżeli jednak wartość EC50 w badaniu przemian azotu dla takich substancji przyjmuje wartość zawartą w tym samym zakresie jak dla handlowo dostępnych inhibitorów nitryfikacji (np. nitrapyrina), to badanie przemian węgla może być wykonane celem zebrania dalszych informacji.
Gleby składają się z żywych i nieożywionych składników, które istnieją w złożonych i heterogenicznych mieszaninach. Mikroorganizmy wraz z wieloma gatunkami mającymi wkład w różne aspekty użyźnienia gleby odgrywają ważną rolę w rozkładzie i przemianach materii organicznej w żyznych glebach. Długoterminowe zakłócenie tych procesów biochemicznych może potencjalnie oddziaływać na krążenie składników odżywczych i poprzez to zmieniać żyzność gleby. Przemiany węgla i azotu następują we wszystkich żyznych glebach. Chociaż zespoły mikroorganizmów odpowiedzialne za te procesy różnią się między glebami, to szlaki przemian są zasadniczo takie same.
Badanie opisane w niniejszej metodzie ma służyć wykrywaniu długoterminowych szkodliwych wpływów substancji na proces przemiany węgla w aerobowych glebach powierzchniowych. Niniejsze badanie jest wrażliwe na wszelkie zmiany wielkości i aktywności zespołów mikroorganizmów odpowiedzialnych za przemiany węgla, ponieważ poddaje te zespoły zarówno stresowi chemicznemu, jak i pozbawia je węgla. Stosowana jest gleba piaszczysta o niskiej zawartości materii organicznej. Do tej gleby dodaje się badaną substancję i inkubuje w warunkach, które pozwalają na szybki metabolizm mikroorganizmów. W takich warunkach źródła łatwo dostępnego węgla w glebie szybko się wyczerpują. Powoduje to niedobór węgla, co zarówno zabija komórki mikroorganizmów, jak i indukuje diapauzę i/lub sporulację. Jeżeli badanie trwa dłużej niż 28 dni, to suma tych reakcji może być oznaczona w badaniu kontrolnym (gleby nietraktowane) jako postępująca utrata metabolicznie aktywnej biomasy mikroorganizmów (zobacz pozycja 7 piśmiennictwa). Jeżeli na biomasę w glebie obciążonej węglem, w warunkach badania, ma wpływ obecność substancji chemicznej, to może ona nie powrócić do tego samego poziomu co w badaniu kontrolnym. Dlatego zakłócenia spowodowane przez badaną substancję w jakimkolwiek momencie podczas badania często będą trwały aż do jego zakończenia.
Badanie, z którego wywodzi się niniejsza metoda badawcza, było pierwotnie zaprojektowane dla substancji, których ilość w glebie można było przewidzieć. Tak jest na przykład w przypadku środków ochrony roślin, dla których znana jest ich ilość stosowana w polu. W przypadku agrochemikaliów wystarczające jest badanie dwóch dawek, jakie przewiduje się lub przypuszcza, że będą stosowane. Agrochemikalia mogą być badane jako substancje aktywne (s.a.) lub jako gotowe formy użytkowe. Jednakże niniejsze badanie nie ogranicza się tylko do substancji chemicznych o możliwym do przewidzenia stężeniu w środowisku. Zmieniając zarówno ilość badanej substancji stosowanej do gleby, jak i sposób opracowania danych, badanie może być również wykonane w przypadku substancji chemicznych, co do których nie jest znana ich spodziewana ilość w glebie. Dlatego dla substancji innych niż agrochemikalia oznacza się wpływ serii stężeń na przemiany węgla. Dane z tych badań używane są do wyznaczenia krzywej zależności dawka-odpowiedź i wyliczenia wartości ECx, gdzie x jest zdefiniowanym % skutku.

1.2. Definicje

Przemiany węgla: to rozkład przez mikroorganizmy materii organicznej prowadzący do wytworzenia dwutlenku węgla jako produktu końcowego.
ECx (Stężenie efektywne): jest stężeniem badanej substancji w glebie powodującym x procent inhibicji przemian węgla do dwutlenku węgla.
EC50 (Medialne stężenie efektywne): jest stężeniem badanej substancji w glebie powodującym 50 % inhibicję przemian węgla do dwutlenku węgla.

1.3. Substancje kontrolne

Brak.

1.4. Zasada metody badawczej

Do przesianej gleby dodaje się badaną substancję lub glebę pozostawia się bez dodatku badanej substancji (kontrola). Jeżeli badane są agrochemikalia, to zaleca się minimum dwa stężenia badanej substancji, które powinny być wybrane w odniesieniu do najwyższego stężenia, jakie przewiduje się w warunkach polowych. Po 0, 7, 14 i 28 dniach inkubacji próbki gleby z substancją badaną i próbki gleby kontrolnej są mieszane z glukozą i po kolejnych 12 godzinach oznacza się oddychanie indukowane glukozą. Oddychanie jest wyrażone jako ilość uwolnionego dwutlenku węgla (mg dwutlenku węgla/kg suchej masy gleby/godzinę) lub ilość zużytego tlenu (mg tlenu/kg gleby/godzinę). Oddychanie w próbkach z substancją badaną jest porównywane z wartością kontrolną i oblicza się procent odchylenia względem kontroli. Wszystkie badania prowadzone są przynajmniej przez 28 dni. Jeżeli w 28 dniu różnica między próbkami kontrolnymi i próbkami z substancją badaną jest równa lub większa niż 25 %, to pomiary są kontynuowane w odstępach 14-dniowych do maksymalnie 100 dni. Jeżeli badane są substancje inne niż agrochemikalia, to do próbek gleby dodaje się substancję w stężeniach stanowiących serię, a oddychanie indukowane glukozą (tj. średnie ilości wytworzonego dwutlenku węgla lub zużytego tlenu) oznacza się po 28 dniach inkubacji. Wyniki badań z wieloma stężeniami analizowane są przy pomocy modelu regresji. Wyliczane są wartości ECx (np.: EC50, EC25 i/lub EC10).

1.5. Wiarygodność badania

Szacowanie wyników badania dla agrochemikaliów opiera się na stosunkowo małych różnicach (tj. średnia wartość ±25 %) pomiędzy uwolnionym dwutlenkiem węgla lub zużytym tlenem w kontroli i próbkach badanych, więc duże odchylenia w kontroli mogą prowadzić do fałszywych wyników. Dlatego zmienność pomiędzy powtórzeniami w kontroli powinna wynosić mniej niż ±15 %.

1.6. Opis metody badawczej

1.6.1.  Wyposażenie

W badaniu stosuje się naczynia testowe wykonane z obojętnego chemicznie materiału. Powinny być one odpowiedniej wielkości w zależności od zastosowanej procedury inkubacji gleb, tj. inkubacji całej partii gleby lub jako seria poszczególnych próbek glebowych (zobacz pkt 1.7.1.2). Należy poczynić starania, by zminimalizować straty wody z jednej strony, a z drugiej by umożliwić wymianę gazową podczas badania (np. naczynia stosowane w badaniu mogą być nakryte perforowaną folią polietylenową). Gdy badane są substancje lotne, powinny być stosowane szczelne i nieprzepuszczalne dla gazu naczynia. Powinny one mieć takie rozmiary, by próbka gleby wypełniała w przybliżeniu jedną czwartą ich objętości.
Do oznaczenia oddychania indukowanego glukozą wymagane są układy inkubacyjne oraz urządzenia do pomiarów wytworzonego dwutlenku węgla lub zużytego tlenu. Przykłady takich układów i urządzeń są opisane w pozycji 8, 9, 10, 11 piśmiennictwa.

1.6.2.  Wybór i liczba gleb

Stosowana jest gleba jednego rodzaju. Zalecana charakterystyka gleby jest następująca:
-   zawartość piasku: nie mniej niż 50 % i nie więcej niż 75 %,
-   wartość pH: 5,5-7,5,
-   zawartość węgla organicznego: 0,5-1,5 %,
-   biomasa mikroorganizmów powinna być oznaczona (zobacz pozycje 12 i 13 piśmiennictwa), a zawartość węgla powinna stanowić przynajmniej 1 % całkowitego węgla organicznego gleby.
Gleba o takich właściwościach jest najbardziej niekorzystnym przypadkiem, ponieważ adsorpcja badanej substancji jest minimalna, a jej dostępność dla mikroflory maksymalna. Dlatego badania z innymi glebami ogólnie są niepotrzebne. Jednakże w pewnych okolicznościach, np. gdy przewidywane zastosowanie badanej substancji będzie miało miejsce na szczególnych glebach, takich jak kwaśne gleby leśne lub w przypadku substancji chemicznych naładowanych elektrostatycznie, konieczne może się okazać zastosowanie dodatkowej gleby.

1.6.3.  Pobieranie i przechowywanie próbek gleby

1.6.3.1.   Pobieranie próbek gleby

Dostępne powinny być szczegółowe informacje dotyczące historii miejsca, z którego pobierana jest gleba do badań. Podać należy dokładne miejsce, rodzaj roślinności pokrywającej, daty zastosowania środków ochrony roślin, zastosowanie nawozów organicznych i nieorganicznych, dodatki materiałów biologicznych lub przypadkowe zanieczyszczenia. Miejsce, z którego pobiera się próby gleby do badań, powinno być tak dobrane, by umożliwić długoterminowe jego użycie. Odpowiednie są pastwiska stale wypasane, pola uprawne z jednorocznymi uprawami zbóż (z wyjątkiem kukurydzy) lub gęsto zasiane zielone łąki. Miejsce wybrane do pobierania próbek nie powinno być podawane zabiegom z użyciem środków ochrony roślin przez minimum jeden rok przed pobraniem próbek. Ponadto przez przynajmniej sześć miesięcy przed pobieraniem prób nie powinno stosować się żadnego nawozu organicznego. Zastosowanie nawozu mineralnego jest możliwe tylko w przypadku wymagania tego przez rośliny uprawne, a próbki gleby nie powinny być pobierane wcześniej niż trzy miesiące po zastosowaniu nawozu. Należy unikać stosowania gleb, na których stosowano nawozy o znanych skutkach działania biobójczego (np. cyjanamid wapnia).
Należy unikać pobierania próbek podczas lub tuż po długich okresach suszy (większe niż 30 dni) lub spływów wody. W przypadku gleb ornych próbki należy pobierać z głębokości 0 do 20 cm. W przypadku łąk (pastwisk) lub innych gleb, gdzie orka nie była przeprowadzana przez długie okresy (przynajmniej jeden sezon), maksymalna głębokość pobierania próbek może wynosić nieco więcej niż 20 cm (np. do 25 cm). Próbki gleby powinny być transportowane w pojemnikach i temperaturze, które gwarantują, że pierwotne właściwości gleby nie zostaną znacząco zmienione.

1.6.3.2.   Przechowywanie próbek gleby

Najbardziej właściwe jest stosowanie gleby świeżo pobranej z pola. Jeżeli jednak nie ma sposobu na uniknięcie przechowywania w laboratorium, to gleby mogą być przechowywane w ciemności w temperaturze 4±2 °C przez maksimum trzy miesiące. Podczas przechowywania gleby należy zapewnić warunki tlenowe. Jeżeli gleby pobiera się z miejsc, gdzie są one zamarznięte przez przynajmniej trzy miesiące w roku, to można rozważyć przechowywanie ich próbek przez sześć miesięcy w temperaturze -18 °C. Biomasę mikroorganizmów w przechowywanych glebach oznacza się przed każdym doświadczeniem. Węgiel w biomasie powinien stanowić przynajmniej 1 % całkowitego węgla organicznego (zobacz pkt 1.6.2).

1.6.4.  Obróbka i przygotowanie gleby przed badaniem

1.6.4.1.   Inkubacja wstępna

Jeżeli gleba była przechowywana (zobacz pkt 1.6.4.2 i pkt 1.7.1.3), zaleca się inkubację wstępną przez odpowiedni okres wynoszący od 2 do 28 dni. Temperatura i wilgotność gleby podczas inkubacji wstępnej powinny być podobne do tych stosowanych w badaniu (zobacz pkt 1.6.4.2 i pkt 1.7.1.3).

1.6.4.2.   Parametry fizykochemiczne

Glebę oczyszcza się ręcznie z dużych zanieczyszczeń (np. kamieni, części roślin) i następnie przesiewa do cząstek o rozmiarach równych lub mniejszych niż 2 mm. Wilgotność gleby powinna być dostosowana za pomocą wody destylowanej lub dejonizowanej do wartości pomiędzy 40 i 60 % maksymalnej pojemności wodnej.

1.6.5.  Przygotowanie badanej substancji w celu dodania do gleby

Badaną substancję podaje się z nośnikiem. Nośnikiem może być woda (dla substancji rozpuszczalnych w wodzie) lub obojętna stała substancja, taka jak drobny piasek kwarcowy (rozmiar cząstek: 0,1-0,5 mm). Należy unikać stosowania płynnych nośników innych niż woda (np. rozpuszczalniki organiczne, takie jak aceton, chloroform), ponieważ mogą one zniszczyć mikroflorę. Jeżeli jako nośnik stosuje się piasek, to może on zawierać badaną substancję rozpuszczoną lub zawieszoną w odpowiednim rozpuszczalniku. W takich przypadkach rozpuszczalnik powinien być usunięty przez odparowanie przed wymieszaniem z glebą. Dla równomiernego rozprowadzenia badanej substancji w glebie zaleca się stosowanie 10 g piasku na kilogram gleby (sucha masa). Do próbek kontrolnych dodaje się taką samą ilość wody i/lub piasku.
Badając substancje lotne, należy na tyle, na ile to możliwe unikać strat podczas ich wprowadzania, a także należy poczynić starania, by w sposób jednorodny rozprowadzić substancję w glebie (np. substancja powinna zostać podana do gleby w kilku miejscach).

1.6.6.  Stężenia substancji badanej

Jeżeli badane są agrochemikalia lub inne substancje chemiczne o możliwym do przewidzenia stężeniu w środowisku, to powinny być zastosowane przynajmniej dwa stężenia. Niższe stężenie powinno odpowiadać przynajmniej maksymalnej ilości spodziewanej w glebie w warunkach praktycznych, natomiast wyższe stężenie powinno być wielokrotnością stężenia niższego. Stężenia badanej substancji dodanej do gleby oblicza się przy założeniu jednorodnego rozmieszczenia do głębokości 5 cm i gęstości gleby równej 1,5. W przypadku agrochemikaliów stosowanych bezpośrednio do gleby lub substancji chemicznych, których ilość w glebie można przewidzieć, zalecane badane stężenia to maksymalne Przewidywane Stężenie w Środowisku (PEC) i jego pięciokrotność. W przypadku substancji, które stosuje się kilkakrotnie w czasie sezonu, badane stężenia wyznacza się, mnożąc PEC przez maksymalną przewidywaną liczbę zastosowań. Jednakże najwyższe stosowane stężenie nie powinno przekraczać dziesięciokrotności maksymalnej jednorazowo zastosowanej dawki.
Jeżeli badane są substancje inne niż agrochemikalia, należy stosować geometryczną serię pięciu stężeń. Badane stężenia powinny obejmować zakres konieczny do wyznaczenia wartości ECx.

1.7. Wykonanie badania

1.7.1.  Warunki narażenia

1.7.1.1.   Stężenia substancji badanej i kontrola

Jeżeli badane są agrochemikalia, badaną próbkę gleby dzieli się na trzy części o równej masie. Dwie części miesza się z nośnikiem zawierającym badany produkt, a trzecią część z nośnikiem bez badanego produktu (kontrola). Zaleca się stosowanie minimum trzech powtórzeń dla stężeń i kontroli. W przypadku badania substancji innych niż agrochemikalia glebę dzieli się na sześć części o równej masie. Pięć z nich miesza się z nośnikiem zawierającym badaną substancję, a szóstą z nośnikiem bez badanej substancji. Zarówno dla kontroli, jak i badanych serii stężeń zaleca się prowadzenie trzech powtórzeń. Należy podjąć wszelkie starania w celu zapewnienia jednorodnego rozprowadzenia badanej substancji w próbkach gleby. Podczas mieszania należy unikać ubijania i zgniatania gleby.

1.7.1.2.   Inkubacja próbek glebowych

Inkubacja próbek glebowych może być przeprowadzona na dwa sposoby: całej partii gleby z badaną substancją i gleby kontrolnej lub z wykorzystaniem równych części poszczególnych próbek gleby kontrolnej i z badaną substancją. Jeżeli badane są substancje lotne, to badania należy prowadzić z serią poszczególnych próbek. Jeżeli inkubuje się całe partie gleby, to należy przygotować dużą ilość próbek kontrolnych i z badaną substancją, żeby podczas badania pobierać z nich małe próbki do analizy. Wyjściowa masa przygotowanej gleby pierwotnej i w stężeniach zależy od rozmiaru próbek pobieranych do analizy, liczby zastosowanych powtórzeń w analizie oraz przewidywanej maksymalnej krotności pobierania. Gleby inkubowane w całości przed pobieraniem próbek do analizy powinny zostać dobrze wymieszane. Jeżeli gleby są inkubowane jako poszczególne próbki, to każda z nich, zarówno kontrolna, jak i z badaną substancją dzielona jest na wymaganą liczbę mniejszych próbek i te są wykorzystywane według potrzeby. W doświadczeniach gdzie przewiduje się więcej niż dwa pobrania próbek do analizy, mniejsze próbki powinny być przygotowane w ilości wystarczającej dla wszystkich powtórzeń we wszystkich punktach czasowych pobierania próbek. Powinny być inkubowane przynajmniej trzy powtórzenia badanej gleby w warunkach tlenowych (zobacz pkt 1.7.1.1). Podczas wszystkich badań stosowane powinny być odpowiednie pojemniki o powierzchni pozwalającej na uniknięcie rozwoju warunków beztlenowych. Jeżeli badane są substancje lotne, badania należy prowadzić z serią poszczególnych próbek.

1.7.1.3.   Warunki i czas trwania badania

Badanie jest wykonywane w ciemności w temperaturze pokojowej 20±2 °C. Wilgotność próbek gleby powinna być utrzymywana w czasie badania pomiędzy 40 % a 60 % maksymalnej pojemności wodnej gleby (zobacz pkt 1.6.4.2) z odchyleniem ±5 %. W miarę potrzeby można dodać wodę destylowaną lub dejonizowaną.
Minimalny czas trwania badania wynosi 28 dni. Jeżeli badane są agrochemikalia, to porównywane są ilości uwolnionego dwutlenku węgla lub zużytego tlenu w próbkach kontrolnych i z badaną substancją. Jeżeli w 28 dniu różnią się one o więcej niż 25 %, to badanie jest kontynuowane, aż osiągnie się różnicę równą lub mniejszą niż 25 % lub przez maksimum 100 dni w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Dla substancji innych niż agrochemikalia badanie kończy się po 28 dniach. Po 28 dniach w próbkach kontrolnych i gleby z badaną substancją oznacza się ilość uwolnionego dwutlenku węgla lub zużytego tlenu i oblicza wartości ECx.

1.7.2.  Pobieranie próbek i analiza gleb

1.7.2.1.   Terminy pobierania próbek gleby

Jeżeli bada się agrochemikalia, to próbki gleby do analizy oddychania indukowanego glukozą pobiera się w 0, 7, 14 i 28 dniu. Jeżeli konieczne jest przedłużenie badania, dalsze pomiary powinny być wykonywane w odstępach 14-dniowych po 28 dniu.
Jeżeli bada się substancje inne niż agrochemikalia to należy stosować przynajmniej pięć stężeń, a oddychanie indukowane glukozą w próbkach glebowych oznacza się na początku (dzień 0) i na koniec okresu narażenia (28 dzień). Dodatkowy pomiar np. w 7 dniu może być również wykonany, jeżeli zostanie to uznane za konieczne. Dane otrzymane 28 dnia są używane do wyznaczenia wartości ECx dla substancji chemicznej. Jeżeli jest to wymagane, to dane z próbek kontrolnych z dnia 0 mogą zostać wykorzystane do podania początkowej ilości metabolicznie aktywnej biomasy mikroorganizmów w glebie (zobacz pozycja 12 piśmiennictwa).

1.7.2.2.   Oznaczanie oddychania indukowanego glukozą

Oddychanie indukowane glukozą w każdym powtórzeniu próbek z badaną substancją i kontroli oznacza się za każdym razem podczas pobierania próbek. Próbki gleby miesza się z odpowiednią ilością glukozy, by wywołać natychmiastową maksymalną reakcję oddychania. Ilość glukozy potrzebna do wywołania maksymalnej reakcji oddychania dla danej gleby może być oznaczona w badaniu wstępnym przy zastosowaniu serii stężeń glukozy (zobacz pozycja 14 piśmiennictwa). Zazwyczaj ilością wystarczającą w przypadku gleby piaszczystej o 0,5-1,5 % zawartości węgla organicznego jest 2.000 mg do 4.000 mg glukozy na kg suchej masy gleby. Glukoza może być zmielona do postaci proszku z czystym piaskiem kwarcowym (10 g piasku/kg suchej masy gleby) i w sposób jednorodny wymieszana z glebą.
Próbki gleby z dodaną glukozą są inkubowane w odpowiednim urządzeniu do ciągłego pomiaru oddychania, co godzinę lub co dwie godziny (zobacz pkt 1.6.1) w temperaturze 20±2 °C. Przez kolejnych 12 godzin oznacza się ilość wytworzonego dwutlenku węgla lub zużytego tlenu, a pomiary powinny zacząć się jak najwcześniej, tj. w ciągu 1 do 2 godzin po dodaniu glukozy. Podczas 12 godzin mierzy się całkowite ilości wytworzonego dwutlenku węgla lub zużytego tlenu i oznacza się średnią wartość oddychania.

2. WYNIKI

2.1. Obliczanie wyników

Jeżeli badanie wykonuje się z agrochemikaliami, to ilość wytworzonego dwutlenku węgla lub zużytego tlenu w każdej próbce powinna być zapisana, a średnie wartości ze wszystkich powtórzeń powinny zostać zestawione w formie tabeli. Wyniki powinny zostać oszacowane za pomocą odpowiedniej i ogólnie uznanej metody statystycznej (np. test F, poziom istotności 5 %). Oddychanie indukowane glukozą wyraża się w mg dwutlenku węgla/kg suchej masy gleby/godzinę lub w mg tlenu/kg suchej masy gleby/godzinę. Średnią ilość wytworzonego dwutlenku węgla lub zużytego tlenu w każdym stężeniu porównuje się z ilością w glebie kontrolnej i oblicza się procent odchylenia względem kontroli.
Jeżeli badanie wykonywane jest dla substancji innych niż agrochemikalia, to określa się ilość wytworzonego dwutlenku węgla lub zużytego tlenu w każdym powtórzeniu i dla oszacowania wartości ECx wyznacza się krzywą zależności dawka-odpowiedź. Oddychanie indukowane glukozą (tj. mg dwutlenku węgla/kg suchej masy gleby/godzinę lub w mg tlenu/kg suchej masy gleby/godzinę) oznaczone w próbkach z badaną substancją po 28 dniach jest porównywane z kontrolą. Z tych danych oblicza się procent inhibicji dla każdego stężenia. Wartości wyrażone w procentach należy korelować z odpowiednimi stężeniami. Procedury statystyczne powinny umożliwić obliczenie wartości ECx. Przy zastosowaniu standardowych procedur (zobacz pozycje 15, 16 i 17 piśmiennictwa) dla obliczonych wartości ECx wyznacza się także przedziały ufności (p=0,95).

2.2. Interpretacja wyników

Jeżeli szacuje się wyniki z badania agrochemikaliów, a różnica w oddychaniu pomiędzy niższą dawką (tj. maksymalnym przewidywanym stężeniem w środowisku) a kontrolą jest równa lub niższa niż 25 % w jakimkolwiek czasie pobierania próbki po 28 dniu, to produkt może zostać scharakteryzowany jako niemający długoterminowego wpływu na przemiany węgla w glebie. Przy szacowaniu wyników z badań substancji innych niż agrochemikalia stosuje się wartości EC50, EC25 i/lub EC10.

3. SPRAWOZDANIE

Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:
Dokładna identyfikacja stosowanej gleby:
-   umiejscowienie geograficzne (długość, szerokość),
-   informacje o historii miejsca (tj. rodzaj roślinności pokrywającej, zastosowane środki ochrony roślin, nawozy, przypadkowe zanieczyszczenia itp.),
-   zastosowanie gleby (gleba rolnicza, leśna itp.),
-   głębokość pobierania gleby (cm),
-   zawartość piasku/iłu/gliny (% suchej masy),
-   wartość pH (w wodzie),
-   zawartość węgla organicznego (% suchej masy),
-   zawartość azotu (% suchej masy),
-   początkowe stężenie azotanów (mg azotanów/kg suchej masy),
-   zdolność wymiany jonowej (mmol/kg),
-   biomasa mikroorganizmów wyrażona w procentach całkowitej zawartości węgla organicznego,
-   metody stosowane do oznaczenia każdego parametru,
-   wszystkie informacje dotyczące pobierania i przechowywania próbek,
-   szczegóły dotyczące wstępnej inkubacji gleby.
Badana substancja:
-   postać fizyczna i istotne właściwości fizykochemiczne,
-   nazwa chemiczna oraz wzór strukturalny, czystość (tj. dla środków ochrony roślin procent substancji aktywnej), zawartość azotu.
Warunki badania:
-   szczegóły dotyczące wzbogacenia gleby substratem organicznym,
-   liczba stężeń badanej substancji i uzasadnienie wyboru stężeń,
-   szczegóły dotyczące podania badanej substancji do gleby,
-   temperatura inkubacji,
-   wilgotność gleby na początku i podczas trwania badania,
-   zastosowana metoda inkubacji gleby (cała partia gleby, czy jako seria poszczególnych próbek gleby),
-   informacja o tym, ile razy pobierano próbki,
-   czas pobrania próbek.
Wyniki:
-   metoda i sprzęt stosowany do pomiarów respiracji,
-   dane zawierające poszczególne wyniki i wartości średnie pomiarów dwutlenku węgla lub tlenu w formie tabel,
-   odchylenia pomiędzy powtórzeniami w próbkach z badaną substancją i kontrolnych,
-   wyjaśnienia poprawek w obliczeniach, jeżeli były konieczne,
-   odchylenia w oddychaniu indukowanym glukozą w każdym czasie pobierania próbek wyrażone w procentach lub w postaci wartości EC50 z 95 % przedziałami ufności, inne wartości ECx (tj. EC25 lub EC10) z przedziałami ufności oraz wykres krzywej zależności dawka-odpowiedź,
-   statystyczne opracowanie wyników, jeżeli jest konieczne,
-   wszystkie informacje i obserwacje pomocne w interpretacji wyników.

4. PIŚMIENNICTWO

 1)   EPPO (1994). Decision - Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
 2)   BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
 3)   EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed Rule. September 28, 1987.
 4)   SETAC - Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC - Europe, Brussels.
 5)   OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
 6)   ISO 10381-6 (1993). Soil quality - Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. PN-ISO 10381-6:1998 Jakość gleby - Pobieranie próbek - Zasady dotyczące pobierania, postępowania z próbkami i przechowywania próbek gleby przeznaczonych do badania tlenowych (aerobowych) procesów mikrobiologicznych w warunkach laboratoryjnych.
 7)   Anderson J. P. E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticides Experiments, in "Pesticide Effects on Soil Microflora". Eds. L. Somerville and M. P. Greaves, Chap. 3: 45-60.
 8)   Anderson J.P.E. (1982). Soil Respiration, in "Methods of Soil Analysis - Part 2: Chemical and Microbiological Properties". Agronomy Monograph N° 9. Eds. A. L. Page, R.H. Miller and D. R. Keeney. 41: 831-871.
 9)   ISO 11266-1 (1993). Soil Quality - Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions. PN-ISO 11266:1997 Jakość gleby - Zasady prowadzenia badań laboratoryjnych nad biodegradacją związków organicznych w glebie w warunkach tlenowych.
 10)  ISO 14239 (1997E). Soil Quality - Laboratory incubation systems for measuring mineralisations of organic chemicals in soil under aerobic conditions. PN-ISO 14239:2000 Jakość gleby - Laboratoryjne metody inkubacji do pomiaru mineralizacji związków organicznych w glebie w warunkach tlenowych.
 11)  Heinemeyer O., Insam H., Kaiser E. A. and Walenzik G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.
 12)  ISO 14240-1 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate - induced respiration method. PN-ISO 14240-1:2001 Jakość gleby - Oznaczanie ilości biomasy mikroorganizmów w glebie - Metoda indukcji oddychania przez dodanie substratu.
 13)  ISO 14240-2 (1997). Soil quality - Determination of microbial biomass - Part 2: Fumigation - extraction method. PN-ISO 14240-2:2001 Jakość gleby - Oznaczanie ilości biomasy mikroorganizmów w glebie - Metoda fumigacji - ekstrakcji.
 14)  Malkomes H.P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120.
 15)  Litchfield, J. T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose - effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
 16)  Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.
17)  Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.

ZAŁĄCZNIK Nr 13

C.23. PRZEMIANY TLENOWE I BEZTLENOWE W GLEBIE

1. METODA

Niniejsza metoda jest równoważna metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 307 (2002).

1.1. Wstęp

Niniejsza metoda badawcza opiera się na istniejących wytycznych (zobacz pozycje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 i 9 piśmiennictwa). Badanie wykonane wg niniejszej metody ma na celu oszacowanie tlenowych i beztlenowych przemian substancji chemicznych w glebie. Doświadczenie wykonuje się, aby określić (i) stopień przemian badanej substancji i (ii) rodzaj i ilości powstających i ulegających rozkładowi produktów przemian, na które mogą być narażone organizmy glebowe i rośliny. Takie badania są wymagane dla substancji chemicznych bezpośrednio stosowanych do gleby lub dla tych, które z dużym prawdopodobieństwem osiągną środowisko glebowe. Wyniki takich badań laboratoryjnych mogą być także wykorzystane przy opracowywaniu metod pobierania próbek i ich analizy w badaniach polowych.
Badania tlenowe i beztlenowe przeprowadzane na jednym rodzaju gleby są na ogół wystarczające do oszacowania szlaków przemian (zobacz pozycje 8, 10 i 11 piśmiennictwa). Stopień przemian powinien być oszacowany przynajmniej w trzech rodzajach gleb (zobacz pozycje 8 i 10 piśmiennictwa).
Na Warsztatach OECD dotyczących wyboru gleb i osadów, które odbywały się we Włoszech, Belgirate w 1995 r. (zobacz pozycja 10 piśmiennictwa), uzgodniono liczbę i rodzaje gleb, które mogą być stosowane w badaniu. Rodzaje badanych gleb powinny być reprezentatywne dla regionu, w którym nastąpi zastosowanie lub uwolnienie substancji. Na przykład substancje, które będą stosowane w regionach tropikalnych i subtropikalnych, powinny być badane na glebach typu Ferrasol i Nitosol (według klasyfikacji FAO). Na Warsztatach podjęto także zalecenia w zakresie pobierania, opracowania i przechowywania próbek glebowych na bazie Wytycznych ISO (zobacz pozycja 15 piśmiennictwa). W metodzie uwzględnia się także stosowanie gleb spod upraw ryżowych.

1.2. Definicje

Badana substancja: każda substancja, w tym związek wyjściowy i odpowiednie produkty przemian.
Produkty przemian: wszystkie substancje pochodzące z reakcji przemian biotycznych lub abiotycznych badanej substancji, w tym CO2 i produkty, które są w związanych pozostałościach.
Związane pozostałości: "Związane pozostałości" stanowią związki w glebie, roślinie lub zwierzęciu, które trwają w matrycy w postaci związku wyjściowego lub jego metabolitów/produktów przemian po ekstrakcji. Metoda ekstrakcji nie powinna znacząco zmieniać samych związków lub struktury matrycy. Sposób wiązania może być częściowo wyjaśniony przez zmianę sposobu ekstrakcji z matrycy lub wyspecjalizowane techniki analityczne. W taki sposób zidentyfikowano na przykład wiązania kowalencyjne jonowe i sorpcyjne, a także "pułapki". Ogólnie tworzenie związanych pozostałości redukuje znacząco biodostępność i bioprzystępność (zobacz pozycja 12 piśmiennictwa) [zmodyfikowane według IUPAC 1984 r. (zobacz pozycja 13 piśmiennictwa)].
Przemiany tlenowe: reakcje zachodzące w obecności tlenu cząsteczkowego (zobacz pozycja 14 piśmiennictwa).
Przemiany beztlenowe: reakcje zachodzące pod nieobecność tlenu cząsteczkowego (zobacz pozycja 14 piśmiennictwa).
Gleba: jest mieszaniną mineralnych i chemicznych organicznych składników, przy czym te drugie składają się ze związków o wysokiej zawartości węgla i azotu i o dużych masach cząsteczkowych, ożywionych przez małe (najczęściej mikro-) organizmy. Gleby mogą znajdować się w dwóch stanach:
a)  niewzruszony, czyli tak jak gleba rozwijała się w czasie z charakterystycznymi powłokami różnych jej rodzajów,
b)  wzruszony, czyli taki, który dotyczy gleb uprawianych lub wtedy gdy pobiera się próbki przez wykopywanie i stosuje w niniejszej metodzie (zobacz pozycja 14 piśmiennictwa).
Mineralizacja: jest pełnym rozkładem związku organicznego do CO2 i H2O w warunkach tlenowych oraz CH4, CO2 i H2O w warunkach beztlenowych. W kontekście niniejszej metody gdy stosuje się związek znakowany 14C, mineralizacja oznacza rozkład, podczas którego znakowany atom węgla jest utleniany z uwolnieniem odpowiedniej ilości 14CO2 (zobacz pozycja 14 piśmiennictwa).
Okres półrozkładu: t0,5, jest czasem potrzebnym na zajście 50 % przemian badanej substancji, jeżeli przemiany można opisać kinetyką pierwszego rzędu; czas ten nie zależy od stężenia.
DT50 (Okres Zanikania 50): jest czasem, w którym stężenie badanej substancji jest zredukowane o 50 %; jest inne od okresu półrozpadu t0,5, gdy przemiany nie następują według kinetyki pierwszego rzędu.
DT75 (Okres Zanikania 75): jest czasem, w którym stężenie badanej substancji jest zredukowane o 75 %.
DT90 (Okres Zanikania 90): jest czasem, w którym stężenie badanej substancji jest zredukowane o 90 %.

1.3. Substancje kontrolne

Substancje kontrolne powinny być stosowane w celu charakteryzacji i/lub identyfikacji produktów przemian metodami spektroskopowymi lub chromatograficznymi.

1.4. Zastosowanie badania

Metoda ma zastosowanie dla wszystkich substancji chemicznych (nieznakowanych lub znakowanych), dla których istnieje metoda analityczna o odpowiedniej czułości i dokładności. Badanie stosuje się dla związków o niewielkiej lotności, nielotnych, rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych w wodzie. Badania nie należy wykonywać dla substancji o wysokiej lotności z gleby (np.: fumiganty, rozpuszczalniki organiczne), których nie można utrzymać w glebie w warunkach doświadczalnych badania.

1.5. Informacje o badanej substancji

Dla pomiaru stopnia przemian stosować można substancje znakowane i nieznakowane. Materiał znakowany jest wymagany do badania szlaków przemian i ustalania bilansu masy. Zalecane jest znakowanie 14C, ale zastosowanie innych izotopów, takich jak 13C, 15N, 3H, 32P, także może być użyteczne.
Na tyle, na ile to możliwe, znacznik powinien być umiejscowiony w najbardziej stabilnej części cząsteczki11. Czystość badanej substancji powinna wynosić przynajmniej 95 %.
Przed wykonaniem badania przemian tlenowych i beztlenowych w glebie na temat badanej substancji powinny być dostępne następujące informacje:
a)  rozpuszczalność w wodzie (wg Metody A.6),
b)  rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych,
c)  prężność par (wg metody A.4) i stała Henry'ego,
d)  współczynnik podziału n-oktanol/woda (wg metody A.8),
e)  trwałość chemiczna w ciemności (hydroliza) (wg metody C.7),
f)  wartość pKa, jeżeli substancja jest podatna na protonowanie lub deprotonowanie [Wytyczna OECD nr 112] (zobacz pozycja 16 piśmiennictwa).
Inne użyteczne informacje to dane o toksyczności badanej substancji dla mikroorganizmów glebowych [wg metod badawczych C.21 i C.22], zobacz pozycja 16 piśmiennictwa.
Dostępne powinny być metody analityczne (w tym metody ekstrakcji i oczyszczania) dla ilościowego oznaczania i identyfikacji badanej substancji i jej produktów przemian.

1.6. Zasada metody badawczej

Próbki gleby poddaje się działaniu badanej substancji i inkubuje w ciemności w kolbkach biometrycznych lub w systemach przepływowych w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych (w stałej temperaturze i wilgotności gleby). Po odpowiednich odstępach czasowych próbki gleby poddaje się procesowi ekstrakcji i oznacza się substancję wyjściową i produkty przemian. Produkty lotne zbiera się do analizy przy użyciu odpowiednich urządzeń absorpcyjnych. Stosując materiał znakowany 14C, można zmierzyć różne stopnie mineralizacji badanej substancji przez związanie uwolnionego 14CO2 i bilans masy, w tym tworzenie związanych pozostałości.

1.7. Kryteria jakości

1.7.1.  Odzysk

Ekstrakcja i analiza przynajmniej podwójnych próbek gleby tuż po dodaniu badanej substancji do gleby daje pierwsze wskazówki co do powtarzalności metody analitycznej i jednorodności zaaplikowania badanej substancji do gleby. Odzyski dla dalszych faz badania można ustalić przez odpowiednie bilansy mas. Odzysk powinien mieścić się w granicach 90 % do 110 % dla substancji znakowanych (zobacz pozycja 8 piśmiennictwa) i 70 % do 110 % dla substancji nieznakowanych (zobacz pozycja 3 piśmiennictwa).

1.7.2.  Powtarzalność i czułość metody analitycznej

Powtarzalność metody analitycznej (z wyłączeniem wydajności początkowej ekstrakcji) w ilościowym oznaczaniu substancji i produktów przemian można sprawdzić przez podwójną analizę tego samego ekstraktu glebowego inkubowanego na tyle długo, aby powstały produkty przemiany.
Granica wykrywalności (LOD) metody analitycznej badanej substancji i produktów przemiany powinna wynosić przynajmniej 0,01 mg/kg gleby (jako badana substancja) lub 1 % zastosowanej dawki, w zależności która z wartości jest niższa. Powinno się także określić granicę oznaczalności (LOQ).

1.7.3.  Dokładność danych przemian

Analiza regresji stężeń badanej substancji jako funkcja czasu daje właściwą informację o wiarygodności krzywej przemian i pozwala na obliczenie przedziałów ufności dla okresów półrozkładu (w przypadku reakcji zachodzącej wg kinetyki pseudopierwszego rzędu) lub wartości DT50 i, jeżeli to właściwe, także wartości DT75 i DT90.

1.8. Opis metody badawczej

1.8.1.  Sprzęt i odczynniki

Systemy inkubacyjne składają się z układów statycznych zamkniętych lub z odpowiednich układów przepływowych (zobacz pozycje 7 i 17 piśmiennictwa). Przykłady układów przepływowych dla gleby i biometrycznych kolb przedstawiono odpowiednio na rysunkach C.23.1 i C.23.2. Obydwa rodzaje systemów inkubacji mają swoje wady i zalety (zobacz pozycje 7 i 17 piśmiennictwa).
Wymagany jest standardowy sprzęt laboratoryjny, a w szczególności:
-   instrumenty analityczne, takie jak GLC, HPLC, TLC wraz z odpowiednimi systemami detekcji do analizowania substancji znakowanych lub nieznakowanych lub do metody rozcieńczeń inwertowanych izotopów,
-   instrumenty dla celów identyfikacyjnych (np. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR),
-   licznik scyntylacyjny,
-   utleniacz dla spalania materiału radioaktywnego,
-   wirówka,
-   sprzęt do ekstrakcji (na przykład probówki wirówkowe do zimnej ekstrakcji i aparat Soxhleta do metody ekstrakcji ciągłej),
-   sprzęt do zatężania roztworów i ekstraktów (np. wyparka obrotowa),
-   łaźnia wodna,
-   urządzenia do mieszania mechanicznego.
Stosowane odczynniki chemiczne to na przykład:
-   NaOH czystości analitycznej, 2 mol/dm3 lub inna właściwa zasada (np. KOH, etanoloamina),
-   H2SO4 czystości analitycznej, 0,05 mol/dm3,
-   glikol etylenowy czystości analitycznej,
-   materiały do absorpcji na ciało stałe, takie jak poliuretany lub wapno sodowe,
-   rozpuszczalniki analityczne czystości analitycznej, takie jak aceton, metanol itp.,
-   ciecz do scyntylacji.

1.8.2.  Zastosowanie badanej substancji

W celu dodania do gleby i rozprowadzenia w niej badanej substancji należy tę substancję rozpuścić w wodzie (dejonizowanej lub destylowanej) lub gdy to konieczne w minimalnej ilości acetonu lub innych rozpuszczalników organicznych (zobacz pozycja 6 piśmiennictwa), w których badana substancja jest wystarczająco rozpuszczalna i trwała. Jednakże ilość wykrywanego rozpuszczalnika nie powinna mieć znaczącego wpływu na aktywność mikrobiologiczną gleby (zobacz pkt 1.5 i pkt 1.9.2-1.9.3). Należy unikać stosowania rozpuszczalników hamujących aktywność mikrobiologiczną, takich jak chloroform, dichlorometan i inne rozpuszczalniki halogenowane.
Badana substancja może być także dodana w postaci ciała stałego, np.: zmieszana z piaskiem kwarcowym (zobacz pozycja 6 piśmiennictwa) lub w małej próbce gleby, która została wysuszona na powietrzu i wyjałowiona. Jeżeli badaną substancję dodaje się za pomocą rozpuszczalnika, to należy doprowadzić do wyparowania rozpuszczalnika przed dodaniem do próbki gleby i następnie do całej niesterylnej gleby do badania.
Dla ogółu substancji chemicznych, których główny szlak dostawania się do gleby to osady ściekowe/działalność rolnicza, badaną substancję powinno się najpierw dodać do osadu, a następnie wprowadzić do próbki gleby (zobacz pkt 1.9.2 i pkt 1.9.3).
Nie zaleca się stosowania produktów w postaci gotowych formulacji. Jednak w przypadku substancji o słabej rozpuszczalności zastosowanie materiału w formulacji może być właściwą alternatywą.

1.8.3.  Gleby

1.8.3.1.   Wybór gleby

Aby określić szlak przemian, stosować można glebę reprezentatywną; zalecane jest stosowanie gleby piaszczysto-ilastej lub gliniasto-ilastej, lub ilastej, lub ilasto-piaskowej [według klasyfikacji FAO i USDA (zobacz pozycja 18 piśmiennictwa)] o wartości pH w granicach 5,5-8,0, zawartości węgla organicznego 0,5-2,5 % i masie mikroorganizmów przynajmniej odpowiadającej 1 % ogólnego węgla organicznego (zobacz pozycja 10 piśmiennictwa).
W badaniach stopnia przemian stosować należy przynajmniej trzy dodatkowe rodzaje gleb, reprezentatywne dla zakresu odpowiednich gleb. Gleby powinny różnić się co do zakresu zawartości węgla organicznego, wartości pH, zawartości gliny i mikroorganizmów (zobacz pozycja 10 piśmiennictwa).
Wszystkie gleby powinny być scharakteryzowane przynajmniej pod względem struktury (% zawartość piasku, % zawartość iłu, % zawartość gliny) [według klasyfikacji FAO i USDA, zobacz pozycja 18 piśmiennictwa], wartości pH, zdolności wymiany kationów, zawartość węgla organicznego, gęstości, cech retencji wody12 oraz biomasy mikroorganizmów (tylko w przypadku badań tlenowych). Dodatkowe informacje o właściwościach gleby mogą być użyteczne podczas interpretacji wyników. Dla określania cech gleby można stosować metody podane w piśmiennictwie (zobacz pozycje 19, 20, 21, 22 i 23 piśmiennictwa). Biomasę mikroorganizmów powinno się oznaczać metodą oddychania indukowanego substratem (SIR) (zobacz pozycje 25 i 26 piśmiennictwa) lub metodami alternatywnymi (zobacz pozycja 20 piśmiennictwa).

1.8.3.2.   Pobieranie, opracowanie i przechowywanie gleb

Dostępne powinny być szczegółowe informacje o historii miejsca, z którego pobiera się glebę do badań. Do szczegółów tych zalicza się dokładną lokalizację miejsca, pokrywę wegetacyjną, zabiegi chemiczne, zabiegi z zastosowaniem nawozów organicznych i nieorganicznych, dodawanie materiałów biologicznych lub informacje o innych zanieczyszczeniach. Jeżeli do gleb, w ciągu ostatnich czterech lat, dodawana była badana substancja lub jej strukturalne pochodne, to gleby te nie powinny być stosowane do badania przemian (zobacz pozycje 10 i 15 piśmiennictwa).
Gleba powinna być świeżo pobrana z pola (z przekroju A lub z górnej 20 cm warstwy) przy zawartości wody pozwalającej na przesiewanie. Dla wszystkich gleb z wyjątkiem uzyskanych z pól ryżowych pobieranie nie powinno być wykonywane podczas lub tuż po długich okresach (<30 dni) suszy, zmarznięcia lub zalania (zobacz pozycja 14 piśmiennictwa). Próbki powinny być transportowane w sposób minimalizujący zmiany w zawartości wody w glebie i trzymane w ciemności z wolnym dostępem powietrza na tyle, na ile to możliwe. Na ogół odpowiednim do tych celów jest luźno zawiązany worek polietylenowy.
Gleba powinna być poddana obróbce jak najszybciej po pobraniu. W celu usunięcia małych kamieni, fauny i pozostałości roślin należy, przed przesianiem przez sito o oczkach 2 mm, usunąć ręcznie roślinność, większe kamienie i faunę. Należy unikać nadmiernego wysuszenia i rozdrobnienia gleby przed przesiewaniem (zobacz pozycja 15 piśmiennictwa).
Gdy pobieranie gleby w zimie jest trudne (gleba zamarznięta lub pokryta śniegiem), to można pobierać ją partiami z gleby przechowywanej w szklarni pod pokrywą roślin (np. trawą lub mieszaniną trawy i koniczyny). Zaleca się, aby badania były wykonane na świeżo pobranej glebie; ale jeżeli pobrana i obrobiona gleba musi być przechowywana przed badaniem, to powinno się zapewnić do tego odpowiednie warunki i jest to możliwe tylko przez ograniczony czas (4±2 °C przez maksimum trzy miesiące) tak, by utrzymać aktywność mikrobiologiczną13. Szczegółowe informacje dotyczące pobierania, obróbki i przechowywania gleb stosowanych w badaniach biotransformacji można znaleźć w pozycjach 8, 10, 15, 26 i 27 piśmiennictwa.
Przed obrobieniem gleby, która będzie stosowana w badaniu, powinna być ona preinkubowana tak, aby wykiełkowały nasiona i można je było usunąć, a następnie ponownie ustaliła się równowaga metabolizmu mikrobiologicznego po zmianie warunków z pobierania lub przechowywania na warunki inkubacyjne. Okres preinkubacji trwający pomiędzy 2 a 28 dni w warunkach temperatury i wilgotności zbliżonych do warunków doświadczenia jest na ogół wystarczający (zobacz pozycja 15 piśmiennictwa). W sumie czas przechowywania i preinkubacji nie powinien przekraczać trzech miesięcy.

1.9. Wykonanie badania

1.9.1.  Warunki doświadczenia

1.9.1.1.   Temperatura doświadczenia

Podczas całego okresu doświadczenia gleby powinny być inkubowane w ciemności w stałej temperaturze odpowiedniej dla warunków klimatycznych, w których stosowana lub uwolniona będzie badana substancja. Zaleca się stosowanie temperatury 20±2 °C dla wszystkich substancji chemicznych, które mogą być stosowane i uwolnione do gleb klimatu umiarkowanego. Temperatura powinna być monitorowana. Dla substancji chemicznych, które mogą być stosowane i uwolnione do gleb w klimacie zimniejszym (np. kraje północne, podczas okresów jesienno-zimowych), dodatkowe próbki gleby powinny być inkubowane w niższej temperaturze (np. 10±2 °C).

1.9.1.2.   Zawartość wilgoci

W badaniach przemian w warunkach tlenowych zawartość wilgoci w glebie14 powinna być dostosowana i utrzymywana w zakresie pF od 2,0 do 2,5 (zobacz pozycja 3 piśmiennictwa). Zawartość wilgoci jest wyrażana jako masa wody przypadająca na masę suchej gleby i powinna być regularnie kontrolowana (np. w dwutygodniowych odstępach) przez ważenie kolbek inkubacyjnych, a straty wody kompensowane przez jej dodawanie (najlepiej stosować wodę kranową wyjałowioną metodą filtracji). Należy podjąć wszelkie starania, aby zminimalizować straty badanej substancji i/lub produktów przemian przez ulatnianie i/lub fotodegradację (jeżeli występuje) podczas regulowania wilgotności.
W przypadku badań w warunkach beztlenowych i poletka ryżowego gleba jest nasycona wodą przez zalanie.

1.9.1.3.   Warunki inkubacji tlenowej

W systemach przepływowych warunki tlenowe są utrzymywane przez przerywane przepływy lub ciągłe napowietrzanie nawilgoconym powietrzem. W kolbach biometrycznych wymiana powietrza następuje przez dyfuzję.

1.9.1.4.   Jałowe warunki tlenowe

Dla uzyskania informacji o istotności przemian abiotycznych badanej substancji próbki gleby mogą być wyjałowione (metody sterylizacji podano w pozycji 16 i 29 piśmiennictwa), traktowane jałową badaną substancją (np. podanie roztworu przez sterylny filtr) i napowietrzane sterylnym nawilgoconym powietrzem, jak opisano w pkt 1.9.1.3. W przypadku gleb z poletek ryżowych sterylizowana powinna być gleba i woda, a inkubacja powinna być przeprowadzona jak podano w pkt 1.9.1.6.

1.9.1.5.   Warunki inkubacji beztlenowej

W celu stworzenia i utrzymania warunków beztlenowych gleba poddana działaniu badanej substancji i inkubowana w warunkach tlenowych przez 30 dni lub okres półrozkładu lub DT50 (w zależności, która z tych wartości jest krótsza) jest następnie zalewana wodą (pokrywa wodna 1-3 cm), a system inkubacyjny przemywany strumieniem obojętnego gazu (np. azot lub argon)15. System badawczy musi umożliwiać pomiar wartości pH, stężenia tlenu i potencjału red-oks oraz zawierać materiały do pochłaniania produktów lotnych. System biometryczny powinien być zamknięty tak, aby uniknąć wnikania powietrza przez dyfuzję.

1.9.1.6.   Warunki inkubacji gleb poletka ryżowego

Dla zbadania przemian w warunkach poletka ryżowego glebę zalewa się 1-5 cm pokrywą wodną, a badaną substancję podaje się do fazy wodnej (zobacz pozycja 9 piśmiennictwa). Zaleca się przynajmniej 5 cm warstwę gleby. System powinien być wentylowany powietrzem tak, jak w warunkach tlenowych. Wartość pH, stężenie tlenu i potencjał red-oks warstwy wodnej powinien być monitorowany i przedstawiony w sprawozdaniu. Przed rozpoczęciem badania przemian konieczny jest przynajmniej dwutygodniowy okres preinkubacji (zobacz pkt 1.8.3.2).

1.9.1.7.   Czas trwania badania

Badania stopnia i szlaków przemian w zasadzie nie powinny przekraczać 120 dni (zobacz pozycje 3, 6 i 8 piśmiennictwa)16, ponieważ po tym czasie w sztucznym układzie laboratoryjnym izolowanym od środowiska należy spodziewać się spadku aktywności biomasy mikroorganizmów glebowych. Jeżeli konieczne jest ustalenie rozpadu badanej substancji oraz tworzenia i rozpadu głównych produktów przemian, to badanie może być kontynuowane przez dłuższe okresy (np. 6 lub 12 miesięcy) (zobacz pozycja 8 piśmiennictwa). Stosowanie dłuższych okresów inkubacji należy uzasadnić w sprawozdaniu; należy jednocześnie prowadzić pomiary biomasy podczas tego okresu i na jego zakończenie.

1.9.2.  Wykonanie badania

Około 50 do 200 g gleby (sucha masa) umieszcza się w każdej kolbce inkubacyjnej (zobacz rysunki C.23.1 i C.23.2 w Schemacie) oraz gleby traktowane badaną substancją jedną z metod opisanych w pkt 1.8.2. Gdy podczas podawania badanej substancji stosuje się rozpuszczalniki organiczne, to należy je usunąć z gleby przez odparowanie. Następnie gleba jest dokładnie mieszana szpatułką i/lub przez wytrząsanie kolbki. Jeżeli badanie jest wykonywane w warunkach poletka ryżowego, to gleba i woda powinny być dokładnie wymieszane po dodaniu badanej substancji. W celu upewnienia się o jednorodnym rozproszeniu małe ilości gleby traktowanej (np. 1 g) powinny być analizowane na zawartość badanej substancji. Alternatywna metoda podana jest poniżej.
Dawka substancji powinna odpowiadać najwyższej zalecanej dawce środka ochrony roślin. Substancja powinna być jednorodnie rozprowadzona na właściwą głębokość w warunkach polowych (np. górna powłoka 10 cm gleby17). Na przykład, dla substancji podawanych na liście lub do gleby, bez inkorporacji, 2,5 cm jest właściwą głębokością do obliczenia ilości substancji w każdej kolbce. Dla substancji wnikających w glebę właściwą głębokością jest ta podana na etykiecie. Ogólnie dla substancji chemicznych dawka powinna być oszacowana na podstawie najbardziej znaczącego sposobu jej przenikania do gleby; na przykład gdy sposobem dostawania się do gleby są osady ściekowe, to substancja powinna być dawkowana w osadach w stężeniu, które będzie odzwierciedlać spodziewane stężenie w osadzie i ilość osadu dodanego do gleby o zastosowaniu rolniczym. Jeżeli to stężenie nie jest na tyle wysokie, aby pozwolić na określenie głównych produktów przemian, to pomocna może być inkubacja dodatkowych próbek gleby o zwiększonej dawce, ale należy unikać zbyt dużych dawek wpływających na funkcjonowanie mikroorganizmów glebowych (zobacz pkt 1.5 i pkt 1.8.2).
Alternatywnie do większej partii (tj. 1 do 2 kg) gleby można dodawać badaną substancję, którą należy ostrożnie wymieszać we właściwym urządzeniu mieszającym i następnie przenieść w małych porcjach 50 do 200 g do kolbek inkubacyjnych (na przykład za pomocą rozdzielaczy prób). Małe ilości (np. 1 g) z gleby traktowanej w całej partii powinno się analizować na zawartość badanej substancji celem upewnienia się o jej jednorodnym rozproszeniu. Preferuje się taki sposób postępowania, ponieważ pozwala on na bardziej jednorodne rozprowadzenie badanej substancji w glebie.
Próbki gleby bez badanej substancji inkubuje się w takich samych warunkach (tlenowych), jak próbki z badaną substancją. Próbki te wykorzystuje się do oznaczeń biomasy pod koniec badania.
Gdy badaną substancję dodaje się do gleby w postaci rozpuszczonej w rozpuszczalnikach organicznych, do próbek gleby dodaje się taką samą ilość rozpuszczalnika i inkubuje w takich samych warunkach (tlenowych), jak próbki z badaną substancją. W celu ustalenia wpływu rozpuszczalnika na biomasę mikroorganizmów próbki te wykorzystuje się do oznaczeń biomasy na początku, podczas i pod koniec badania.
Probówki zawierające glebę z badaną substancją są także dołączane do systemu przepływowego opisanego na rysunku C.23.1 lub zamykane kolumną absorpcyjną przedstawioną na rysunku C.23.2 (zobacz Schemat).

1.9.3.  Pobieranie prób i pomiary

Podwójne serie kolb inkubacyjnych usuwa się we właściwych odstępach czasowych, a próbki gleby poddaje się ekstrakcji odpowiednimi rozpuszczalnikami o różnej polarności i analizuje na zawartość badanej substancji i/lub produktów przemian. Dobrze zaprojektowane badanie zapewnia wystarczającą ilość kolb, tak aby używać dwóch kolb w każdym badaniu próbki. Usuwa się także roztwory absorpcyjne lub stałe materiały absorpcyjne w różnych odstępach czasowych (7-dniowe odstępy podczas pierwszego miesiąca, następnie w okresie po pierwszym miesiącu w odstępach 17-dniowych) podczas badania i pod koniec okresu inkubacji każdej próbki i analizuje się na zawartość substancji lotnych. Oprócz próbki gleby pobranej bezpośrednio przed podaniem materiału badanego (dzień 0) dołączyć należy przynajmniej pięć próbek pobranych w dodatkowych terminach. Odstępy czasowe należy dobrać w taki sposób, aby można było ustalić model rozpadu badanej substancji i model rozpadu i tworzenia produktów przemiany (np.: dni 0, 1, 3, 7; tygodnie 2, 3; miesiące 1, 2, 3).
Jeżeli stosuje się substancję znakowaną 14C to radioaktywność, która nie jest ekstrahowalna, będzie określona przez spalanie. Bilans masy oblicza się dla każdego czasu pobierania próbek.
W przypadku inkubacji w warunkach beztlenowych i w przypadku poletka ryżowego fazę glebową i wodną analizuje się na zawartość badanej substancji i produktów przemian razem lub osobno przez filtrację lub odwirowanie przed ekstrakcją i oznaczaniem.

1.9.4.  Badania opcjonalne

Przy ustalaniu wpływu temperatury i wilgotności gleby na stopień przemian badanej substancji i/lub jej produktów przemian w glebie pomocne mogą być badania w warunkach tlenowych, niesterylnych w dodatkowych temperaturach i wilgotnościach gleby.
Można dokonać charakterystyki radioaktywnej części, nieulegającej ekstrakcji, np. wykorzystując metodę nadkrytycznej ekstrakcji fluidalnej.

2. WYNIKI

2.1. Opracowanie wyników

Ilości badanej substancji, produktów przemian, substancji lotnych (wyrażone tylko w %) i nieulegających ekstrakcji pozostałości powinny być wyrażone jako % stosowanego stężenia początkowego i gdy to właściwe w postaci mg/kg gleby (w przeliczeniu na suchą masę gleby) dla każdego okresu pobierania prób. Bilans masy dla każdego czasu pobierania prób należy przedstawić jako procent stosowanego stężenia początkowego. Graficzne przedstawienie stężeń badanej substancji względem czasu pozwala na oszacowanie jej półokresu przemian lub wartości DT50. Należy zidentyfikować główne produkty przemian, a ich stężenia powinny być przedstawione na wykresie względem czasu w celu wykazania ich wytworzonych ilości oraz rozpadu. Głównym produktem przemian jest każdy produkt stanowiący ł10 % zastosowanej dawki w jakimkolwiek czasie podczas badania.
Związane produkty lotne dają pewną wiedzę na temat potencjału do lotności badanej substancji i jej produktów przemian z gleby.
Bardziej dokładne oszacowania okresów półrozkładu lub wartości DT50 i, jeżeli to właściwe, wartości DT75 i DT50 powinno się otrzymać przez zastosowanie odpowiedniego modelu obliczeń kinetycznych. Wartości okresów półrozkładu lub wartości DT50 powinny być przedstawione wraz z opisem zastosowanego modelu, rzędowości kinetyki reakcji i określeniem współczynnika (r2). Preferuje się kinetykę pierwszego rzędu, dopóki r2>0,7. Gdy to właściwe, to obliczenia należy także przedstawić dla głównych produktów przemian. Przykłady odpowiednich modeli są opisane w pozycjach 31, 32, 33, 34 i 35 piśmiennictwa.
W przypadku badań wykonywanych w różnych temperaturach stopień przemiany powinien być opisany w postaci funkcji temperatury w zakresie temperatur doświadczalnych przy zastosowaniu równania Arrheniusa:

gdzie:
-   ln A i B są stałymi regresji odpowiednio przecięciem i nachyleniem najdokładniej dopasowanej linii powstałej po liniowej regresji ln k względem 1/T,
-   k jest stałą w temperaturze T,
-   T jest temperaturą wyrażona w kelwinach.
Należy wziąć pod uwagę wąski zakres temperatur, w którym równanie Arrheniusa jest spełnione, gdy przemiany są powodowane aktywnością mikroorganizmów.

2.2. Oszacowanie i interpretacja wyników

Chociaż badania wykonywane są w sztucznym układzie laboratoryjnym, to wyniki pozwalają na oszacowanie stopnia przemian badanej substancji oraz stopnia tworzenia i rozpadu produktów przemian w warunkach polowych (zobacz pozycje 36 i 37 piśmiennictwa).
Badanie szlaków przemian substancji dostarcza informacji o sposobie zmian strukturalnych badanej substancji w glebie na drodze reakcji chemicznych i mikrobiologicznych.

3. SPRAWOZDANIE

Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:
Badana substancja:
-   nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna, numer CAS, wzór strukturalny (wskazując pozycję znaczników, gdy stosowano materiał znakowany radioaktywnie) i ważne właściwości fizykochemiczne (zobacz pkt 1.5),
-   czystość (zanieczyszczenia) badanej substancji,
-   czystość radiochemiczna znakowanego związku i specyficzna aktywność (gdy to właściwe).
Substancja kontrolna:
-   nazwa chemiczna i struktura substancji kontrolnej stosowanej do opisu i/lub identyfikacji produktu przemiany.
Badane gleby:
-   szczegóły dotyczące miejsca pobrania,
-   data i sposób pobrania,
-   właściwości gleby, takie jak: wartość pH, zawartość węgla organicznego, skład (% piasku, % iłu, % gliny), zdolność wymiany jonów, gęstość ogólna, retencja wody, biomasa mikroorganizmów,
-   długość okresu przechowywania i warunki przechowywania (jeżeli była przechowywana).
Warunki badania:
-   daty wykonania badania,
-   ilość dodanej badanej substancji,
-   stosowane rozpuszczalniki i metoda zaaplikowania badanej substancji,
-   masa gleby traktowanej na początku badania i pobieranej w każdym interwale czasowym,
-   opis stosowanego systemu inkubacyjnego,
-   ilości przepływającego powietrza (tylko dla systemów przepływowych),
-   temperatura w czasie doświadczenia,
-   wilgotność gleby podczas inkubacji,
-   początkowa biomasa mikroorganizmów, następnie podczas badania i na koniec w warunkach tlenowych,
-   wartość pH, stężenie tlenu i potencjał red-oks na początku badania, podczas i na koniec badania w warunkach beztlenowych i poletka ryżowego,
-   metody ekstrakcji,
-   metody oznaczania ilościowego i identyfikacji badanej substancji i głównych produktów przemian w glebie i materiałach absorpcyjnych,
-   liczba powtórzeń i liczba kontroli.
Wyniki:
-   wyniki oznaczenia aktywności mikrobiologicznej,
-   powtarzalność i czułość stosowanych metod analitycznych,
-   stopień odzysku (wartości % dla zwalidowanego badania podano w pkt 1.7.1),
-   tabelaryzowane wyniki wyrażone jako % stosowanej początkowej dawki i, gdy to właściwe, jako mg/kg gleby (na podstawie suchej masy),
-   bilans masy podczas i na koniec badania,
-   opis nieekstrahowalnej (związanej) radioaktywności lub pozostałości w glebie,
-   ilościowe oznaczenie uwolnionego CO2 i innych lotnych związków,
-   wykresy stężeń glebowych względem czasu dla badanej substancji i, gdy to właściwe, dla głównych produktów przemian,
-   okres półrozkładu lub DT50, DT75 i DT90 dla badanej substancji i, gdy to właściwe, dla głównych produktów przemian wraz z przedziałami ufności,
-   oszacowanie stopnia degradacji abiotycznej w warunkach sterylnych,
-   oszacowanie kinetyki przemian dla badanej substancji i, gdy to właściwe, dla głównych produktów przemian,
-   proponowane szlaki przemian, gdy to właściwe,
-   dyskusja i interpretacja wyników,
-   dane pierwotne (tj. wybrane chromatogramy, wybrane obliczenia stopnia przemian i sposoby identyfikacji produktów przemian).

4. PIŚMIENNICTWO

 1)   US-Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
 2)   Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.
 3)   European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex II, Part A and Annex III, Part A: Fate and Behaviour in the Environment.
 4)   Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
 5)   BBA (1986). Richtlinie fur die amtliche Prüfung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden-Abbau, Umwandlung und Metabolismus.
 6)   ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality-Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil - Part 1: Aerobic conditions. PN-ISO 11266:1997 Jakość gleby - Zasady prowadzenia badań laboratoryjnych nad biodegradacją związków organicznych w glebie w warunkach tlenowych.
 7)   ISO 14239 (1997). Soil Quality-Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions. PN-ISO 14239:2000 Jakość gleby - Laboratoryjne metody inkubacji do pomiaru mineralizacji związków organicznych w glebie w warunkach tlenowych.
 8)   SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.
 9)   MAFF - Japan 2000 - Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil - Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).
 10)  OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
 11)  Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.
 12)  DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley - VCH (1998).
 13)  T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).
 14)  OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).
 15)  ISO 10381-6 (1993). Soil Quality - Sampling - Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. PN-ISO 10381-6:1998 Jakość gleby - Pobieranie próbek - Zasady dotyczące pobierania, postępowania z próbkami i przechowywania próbek gleby przeznaczonych do badania tlenowych (aerobowych) procesów mikrobiologicznych w warunkach laboratoryjnych.
 16)  Annex V to Dir. 67/548/EEC.
 17)  Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley § Sons. Vol 1, 85-114.
 18)  Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
 19)  Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
 20)  Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
 21)  ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality - General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.
 22)  Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.
 23)  Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.
 24)  Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215-221.
 25)  ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method. PN-ISO 14240-1:2001 Jakość gleby - Oznaczanie ilości biomasy mikroorganizmów w glebie - Metoda indukcji oddychania przez dodanie substratu. PN-ISO 14240-2:2001 Jakość gleby - Oznaczanie ilości biomasy mikroorganizmów w glebie - Metoda fumigacji - ekstrakcji.
 26)  Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor § Francis, 45-60.
 27)  Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and biotransformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105-120.
 28)  Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).
 29)  Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).
 30)  Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197-200.
 31)  Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
 32)  Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181-199.
 33)  Goring, CA.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In "Environmental Dynamics of Pesticides". R. Haque and V.H. Freed, Eds., 135-172.
 34)  Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz-Nachrichten Bayer 39, 188-204.
 35)  Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz-Nachrichten Bayer 33, 47-60.
 36)  Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032-1041.
 37)  Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 83-122.

TABELA C.23.1

PRĘŻNOŚĆ WODY, POJEMNOŚĆ POLOWA (FC) I CAŁKOWITA POJEMNOŚĆ WODNA (WHC)1)

Wysokość słupa wody [cm]
	pF(a)	bar(b)	Uwagi
107	7	104	Sucha gleba
1,6 104	4,2	16	Punkt więdnięcia
104	4	10
103	3	1
6x102	2,8	0,6
3,3x102 102	2,5 2	0,33(c) 0,1	Zakres pojemności polowej(d)
60	1,8	0,06
33	1,5	0,033
10 1	1 0	0,01 0,001	WHC (przybliżenie) Gleba nasycona wodą

_(a) pF = log cm słupa wody.
_(b) 1 bar = 105 Pa.
_(c) Odpowiada przybliżonej 10 % zawartości wody w piasku, 35 % w ile i 45 % w glinie.
_(d) Pojemność polowa nie jest stała, ale waha się w zależności od rodzaju gleby pomiędzy pF 1,5 i 2,5.


Ciśnienie ssania gleby jest mierzone w cm słupa wody lub w barach. Ze względu na duży zakres prężności jest wyrażane jako pF, które jest ekwiwalentem logarytmu cm słupa wody.
Pojemność polowa jest definiowana jako ilość wody, która może być zatrzymana względem grawitacji przez naturalną glebę 2 dni pod dłuższym okresie opadów lub odpowiednim nawodnieniu. Określana jest w glebie niewzruszonej in situ w warunkach polowych. Pomiaru nie można więc zastosować dla gleb laboratoryjnych. Wartości FC oznaczone w glebach wzruszonych mogą charakteryzować się wielką zmiennością.
Pojemność wodna jest określana w laboratorium we wzruszonej i niewzruszonej glebie przez nasycenie kolumny gleby wodą przez transport kapilarny. Jest szczególnie użyteczna dla gleb wzruszonych i może być do 30 % większa od pojemności polowej (zobacz pozycja 1 piśmiennictwa). Jest także doświadczalnie łatwiejsza do określenia niż wiarygodne wartości FC.


1) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.

TABELA C.23.2:

ZAWARTOŚĆ WILGOTNOŚCI (g wody na 100 g suchej gleby) RÓŻNYCH RODZAJÓW GLEBY Z RÓŻNYCH KRAJÓW

			Zawartość wilgotności gleby w
Rodzaj gleby	Kraj
		WHC1	pF = 1,8	pF = 2
Piaszczysta	Niemcy	28,7	8,8	3
Ilasto-piaszczysta	Niemcy	50,4	17,9	12
Ilasto-piaszczysta	Szwajcaria	44,0	35,3	9
Pył ilasty	Szwajcaria	72,8	56,6	28
Gliniasto-ilasta	Brazylia	69,7	38,4	27
Gliniasto-ilasta	Japonia	74,4	57,8	31
Piaszczysto-ilasta	Japonia	82,4	59,2	36
Pył ilasty	USA	47,2	33,2	18
Piaszczysto-ilasta	USA	40,4	25,2	13

₁₎ Całkowita pojemność wodna.


Schemat:


Rysunek C.23.1

Parametr	Faza badania
	pobieranie próby	obróbka	początek aklimatyzacji	początek badania	badanie	koniec badania
Woda
Pochodzenie/źródło	x
Temperatura	x
Wartość pH	x		x	x	x	x
TOC			x	x		x
Stężenie* O2	x		x	x	x	x
Potencjał red-oks*			x	x	x	x
Osad
Pochodzenie/źródło	x
Głębokość powłoki	x
Wartość pH		x	x	x	x	x
Rozkład rozmiarów cząstek		x
TOC		x	x	x		x
Biomasa mikroorganizmów**		x		x		x
Potencjał red-oks *	Obserwacja (kolor/zapach)		x	x	x	x